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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » RNA提取完，直接PCR，总是有条带、 怎么解？
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joeming123

银虫 (小有名气)

[求助] RNA提取完，直接PCR，总是有条带、 怎么解？已有3人参与

问题： 用热酚法提取大肠杆菌RNA， 电泳显示有基因组污染， 然后进行Dnase I酶消解，跑电泳，无基因组条带，
            取10ng消解后的RNA，用大肠杆菌16s引物直接PCR。  有很亮的条带？
           然后，将消解后的RNA抽提，继续用DNae I消解， 做PCR，还是有亮带。  
有人遇到这种问题么？ 怎么解怎么破？  
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现在的路越来越难走
1楼2016-09-14 15:58:52
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joeming123

银虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by biozhajie at 2016-09-20 08:53:01
扩增片段多长 如果不长 taq酶也有定的逆转录功能 所以短片段在未逆转录的情况下也能扩出 只不过效率会低点

哦，但是提取其他组织的RNA时，就扩不出来，  就是提取的大肠杆菌RNA，  就扩增得出来。  所以我觉得不是您说的那个原因哦。
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现在的路越来越难走
11楼2016-09-20 13:45:53
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查看全部 11 个回答

kuaile5420

专家顾问 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
joeming123: 金币+10, ★有帮助 2016-09-19 15:02:30
xn8008: 欢迎发帖交流 2016-09-20 08:34:45
有做阴性对照吗？单独做一个孔，不加模板，仅仅加水，检测下你的PCR体系是否存在污染了？
赞一下 回复此楼
坚持到底就是胜利！
2楼2016-09-14 19:49:46
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joeming123

银虫 (小有名气)
xn8008: 欢迎发帖交流 2016-09-20 08:34:51
引用回帖:
2楼: Originally posted by kuaile5420 at 2016-09-14 19:49:46
有做阴性对照吗？单独做一个孔，不加模板，仅仅加水，检测下你的PCR体系是否存在污染了？

有阴性对照，PCR体系无污染
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现在的路越来越难走
3楼2016-09-18 16:06:25
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winyuyuyu123

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
joeming123: 金币+10, ★★★很有帮助 2016-09-19 15:02:38
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-09-20 08:34:56
请问楼主用的是否是大肠杆菌16srDNA通用引物？楼主用的什么酶进行的扩增？
有木有可能是如下原因：
1.16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌染色体基因中。
2.部分Taq酶在扩增过程中，允许模板中含有dUTP。
由此得出：
楼主获得的片段其实就是以RNA为模板扩增得到的条带。
建议：
1.换用高保真酶，如KOD-Plus等，不能以含dUTP的模板扩增的酶，再试试。
2.设置阳性对照，以大肠杆菌gDNA为模板，高保真酶进行扩增。
3.将RNA样品取少量，用RNA酶处理后再用原来的酶扩增，看条带是否还存在。
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4楼2016-09-19 14:10:44
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