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joeming123银虫 (小有名气)
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RNA提取完，直接PCR，总是有条带、 怎么解？ 已有3人参与
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问题： 用热酚法提取大肠杆菌RNA， 电泳显示有基因组污染， 然后进行Dnase I酶消解，跑电泳，无基因组条带， 取10ng消解后的RNA，用大肠杆菌16s引物直接PCR。 有很亮的条带？ 然后，将消解后的RNA抽提，继续用DNae I消解， 做PCR，还是有亮带。 有人遇到这种问题么？ 怎么解怎么破？  |
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【答案】应助回帖
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joeming123: 金币+10, ★★★很有帮助 2016-09-19 15:02:38
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-09-20 08:34:56
joeming123: 金币+10, ★★★很有帮助 2016-09-19 15:02:38
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-09-20 08:34:56
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请问楼主用的是否是大肠杆菌16srDNA通用引物？楼主用的什么酶进行的扩增？ 有木有可能是如下原因： 1.16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌染色体基因中。 2.部分Taq酶在扩增过程中，允许模板中含有dUTP。 由此得出： 楼主获得的片段其实就是以RNA为模板扩增得到的条带。 建议： 1.换用高保真酶，如KOD-Plus等，不能以含dUTP的模板扩增的酶，再试试。 2.设置阳性对照，以大肠杆菌gDNA为模板，高保真酶进行扩增。 3.将RNA样品取少量，用RNA酶处理后再用原来的酶扩增，看条带是否还存在。 |
4楼2016-09-19 14:10:44
懒蛋
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9楼2016-09-20 08:53:01
kuaile5420
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3楼2016-09-18 16:06:25
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【答案】应助回帖
xn8008: 欢迎发帖交流 2016-09-20 08:35:15
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DNaseⅠ是一种内切酶，镁离子存在条件下，DNase I可随机剪切双链DNA的任意位点;二价锰离子存在条件下，DNase I可在同一位点剪切DNA双链，形成平末端，或1-2个核苷酸突出的粘末端。因此其消解效率与dna是环状与否关系不大，比如，常用限制性内切酶可以用于基因组酶切，也可将环状质粒线性化。建议楼主可以取少量的质粒dna做一个对照实验，消解后电泳，看环状质粒是否还存在。 发自小木虫Android客户端 |
6楼2016-09-19 23:02:19
7楼2016-09-20 08:27:14
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