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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白/酶 » 用考马斯亮蓝G250做标曲，吸光度值低
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ohc1414

木虫 (正式写手)

[交流] 用考马斯亮蓝G250做标曲，吸光度值低

配bradford染夜，是10mg g250溶于95乙醇5ml ，加入10ml 85磷酸，100ml蒸馏水定容（网上说配的游离是红色，我加入乙醇时是蓝色的）
用之前减压抽滤
酶（HRP）的浓度是100ug/ml
酶与染液的体积比是1:5
在震荡器避光震荡十分钟，（颜色有些偏透明 棕色）
但是测得吸光度值特别低，0.020-0.070
在这滞留太久了，也没有找到原因，请前辈指点一二

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1楼 2016-09-12 16:40:21
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匿名
本帖仅楼主可见
2楼2016-09-12 16:53:59
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wwbqzhj

铜虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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ohc1414: 金币+1 2016-09-12 23:30:52
ohc1414: 金币+5 2016-09-12 23:31:22
应该是蛋白浓度过低，做标准曲线一般用的蛋白浓度依次为0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml，还有你具体步骤是什么？不太理解
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3楼2016-09-12 17:20:56
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ohc1414

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by wwbqzhj at 2016-09-12 17:20:56
应该是蛋白浓度过低，做标准曲线一般用的蛋白浓度依次为0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml，还有你具体步骤是什么？不太理解

可文献的浓度一般都是100ug/ml啊，而且用考马斯亮蓝法需要保证g20过量吧，如果按前辈的浓度达不到那个条件吧

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4楼2016-09-12 23:30:45
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gyhsonic

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
ohc1414: 金币+5, 谢谢，我试试 2016-09-13 10:25:47
乙醇加进去是蓝色，浓磷酸加进去后应该会变成棕色的就没问题，配好后是蓝色说明容器或者试剂有蛋白的污染。mg/ml是指加进去的bsa的浓度，终浓度是ug/ml的。

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5楼2016-09-13 00:11:21
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wwbqzhj

铜虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
ohc1414: 金币+4, 谢谢，我试试 2016-09-13 10:26:20
引用回帖:
4楼: Originally posted by ohc1414 at 2016-09-12 23:30:45
可文献的浓度一般都是100ug/ml啊，而且用考马斯亮蓝法需要保证g20过量吧，如果按前辈的浓度达不到那个条件吧
...

我们标曲是这样操作的，用BSA作为标准蛋白，分别取20ul浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1的标准蛋白溶液加入到96孔酶标板中，再分别加入G250溶液200ul，室温放置3-5min，在酶标仪568nm测吸光度，做标曲
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6楼2016-09-13 08:50:15
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1769935

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
大神请问尿液能用考马斯亮蓝G250测浓度吗？测出每毫升含多少毫克，然后乘以尿量，得出这么多尿里的蛋白总量。

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7楼2017-04-24 10:39:40
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