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ohc1414

木虫 (正式写手)

[交流] 用考马斯亮蓝G250做标曲,吸光度值低

配bradford染夜,是10mg g250溶于95乙醇5ml ,加入10ml 85磷酸,100ml蒸馏水定容(网上说配的游离是红色,我加入乙醇时是蓝色的)
用之前减压抽滤
酶(HRP)的浓度是100ug/ml
酶与染液的体积比是1:5
在震荡器避光震荡十分钟,(颜色有些偏透明 棕色)
但是测得吸光度值特别低,0.020-0.070
在这滞留太久了,也没有找到原因,请前辈指点一二

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2楼2016-09-12 16:53:59
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wwbqzhj

铜虫 (正式写手)

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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ohc1414: 金币+1 2016-09-12 23:30:52
ohc1414: 金币+5 2016-09-12 23:31:22
应该是蛋白浓度过低,做标准曲线一般用的蛋白浓度依次为0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml,还有你具体步骤是什么?不太理解
3楼2016-09-12 17:20:56
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ohc1414

木虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by wwbqzhj at 2016-09-12 17:20:56
应该是蛋白浓度过低,做标准曲线一般用的蛋白浓度依次为0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.6mg/ml、0.8mg/ml,还有你具体步骤是什么?不太理解

可文献的浓度一般都是100ug/ml啊,而且用考马斯亮蓝法需要保证g20过量吧,如果按前辈的浓度达不到那个条件吧

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4楼2016-09-12 23:30:45
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gyhsonic

新虫 (初入文坛)

★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
ohc1414: 金币+5, 谢谢,我试试 2016-09-13 10:25:47
乙醇加进去是蓝色,浓磷酸加进去后应该会变成棕色的就没问题,配好后是蓝色说明容器或者试剂有蛋白的污染。mg/ml是指加进去的bsa的浓度,终浓度是ug/ml的。

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5楼2016-09-13 00:11:21
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wwbqzhj

铜虫 (正式写手)

★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
ohc1414: 金币+4, 谢谢,我试试 2016-09-13 10:26:20
引用回帖:
4楼: Originally posted by ohc1414 at 2016-09-12 23:30:45
可文献的浓度一般都是100ug/ml啊,而且用考马斯亮蓝法需要保证g20过量吧,如果按前辈的浓度达不到那个条件吧
...

我们标曲是这样操作的,用BSA作为标准蛋白,分别取20ul浓度为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1的标准蛋白溶液加入到96孔酶标板中,再分别加入G250溶液200ul,室温放置3-5min,在酶标仪568nm测吸光度,做标曲
6楼2016-09-13 08:50:15
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1769935

新虫 (初入文坛)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
大神请问尿液能用考马斯亮蓝G250测浓度吗?测出每毫升含多少毫克,然后乘以尿量,得出这么多尿里的蛋白总量。

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7楼2017-04-24 10:39:40
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