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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 有关PCR的几个问题
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candy8402

[交流] 有关PCR的几个问题

最近做了一个月的PCR，第一次是师姐加样，做出了漂亮的条带，第二次自己做，同样的试剂，同样的条件，可能加样没加好，没有做出来。第三次再做做出来了，但第四次第五次就又没有条带了，换了模板，测了比值为1.76，浓度为0.162，25的体系加了0.5微升。还是没有条带，想请教大家，像我这样做出过两次还需不需要摸别的条件？还需注意些什么？排除什么别的问题？另外，我的试剂没有分装，每次做都从冰箱拿出来解冻，做完了再放-20度的冰箱，是不是会影响试剂？我也没有在冰上配体系，是否也有关系？一般模板浓度加多少？我的是人血DNA。
谢谢！
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1楼 2008-11-20 18:35:01
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candy8402

有人能指点一下吗？不甚感激！
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2楼2008-11-20 20:03:20
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
Taq酶很容易失活~~~
买了大包装的酶就要分装
如果不在冰上操作………………………………酶很快很快就挂掉
所谓的热启动酶无需冰上配，那个酶也还是要放在冰上的
其他组分倒无所谓
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3楼2008-11-20 20:07:06
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candy8402

酶这么脆弱吗？我买的很贵，IBM的，2000块就5100微升。每次用只在外面放几分钟就放回冰箱了，这样也会失活吗？
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4楼2008-11-20 20:11:42
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candy8402

写错了，是100微升的
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5楼2008-11-20 20:12:59
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
IBM？？？
蓝色巨人何时出酶了……

拿出来的时候就放冰上，然后尽快放回去

你找一些好做的基因看看能不能P出来，出不来就是酶失活了

100ul 2000元这没什么好惊讶的，要看是多少个单位的
普通的PCR我用promega的GoTaq，一个单位3元吧，忘记了
Invitrogen的白金高保真Taq是一个单位8元（原价），现在促销是4元，用这个酶我还遇到过P不出来的片段
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6楼2008-11-20 20:22:09
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candy8402

ABI的，不好意思又写错了。
这个牌子如何？
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7楼2008-11-20 20:31:58
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candy8402

我P出来过，那条件和引物应该没有问题了吧？
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8楼2008-11-20 20:33:41
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
ABI的酶也不见得好到哪里去
其实是性价比的问题
以前能够P出来，现在出不来，首先考虑这段时间换过什么了
dNTP、水之类的有没有换过？会不会污染了
机器有没有换过？
最后，酶是否失活了
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9楼2008-11-20 21:07:05
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candy8402

嗯，非常感谢楼上的答复。
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10楼2008-11-20 21:19:39
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