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tolomua

新虫 (初入文坛)

[交流] 做得想死,WB验证的结果RT-PCR却重复不出来 已有1人参与

是这样的,实验组处理抬高了基因A的表达,名为cell-A,对照组是cell-nc
做完这个处理后,经WB验证有效,细胞形态和活力也有很大差异
之后我要做RT-PCR,设想的是,实验组抬高的基因A会影响基因BCDE……的表达
但是RT-PCR的结果发现没什么差异,就连基因A也没有差异
我曾经想过是不是基因碱基发生同义突变导致引物没有将它们P出来,但那么多个基因同时突变的可能性太小了

提取RNA和RT的过程都很顺利,所有引物同组在别的细胞上做过没问题,那么,还有可能是什么问题呢?
我已经做了三次了,每次都是从处理开始做,每次都是这个狗样子,实在是太灰心了,希望能够得到大家的帮助
我的金币数少于5悬赏不了,所以只能发在交流版,抱歉
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kuaile5420

专家顾问 (著名写手)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
你是通过什么途径提高了A基因的表达?过表达还是说药物处理?推测你是药物处理,通过加入某种东西刺激了A基因的表达。你说WB很显著?到底是多显著?能否看下图片?还有就是A基因的表达水平是怎样的?能否告诉你做RT-qPCR起始的RNA量以及最终该基因的Ct值?最关键的一点就是你的WB结果有做生物学重复吗?还是就做了一次很显著呢?如果你做了几次都是这样的话,即使RT-qPCR没有显著差异也是可以理解的,因为蛋白量的上调有两种途径,一是mRNA上调(可以通过RT-qPCR和WB检测),二是降解减少(仅仅可以通过WB检测),如果你的是第二种情况的话,那么建议从蛋白质降解途径入手重新思考这个问题。
坚持到底就是胜利!
2楼2016-09-09 08:48:58
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