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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 【急】求助：我的PCR总是扩不出来~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~
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bbyu007

木虫 (正式写手)

[交流] 【急】求助：我的PCR总是扩不出来~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~

这几天一直在做PCR，目的是扩水稻中某个基因的启动子序列。根据此基因前面2k序列设计引物，模板是水稻日本晴的全基因组DNA，但是一直扩不出来（检测时除了前面有引物二聚体带以外，什么都没有）！！！下午有做了不同退火温度的梯度试验，也是什么都没有！！！
体系是20ul：模板2ul，DNTP2ul，buffer（含mg+2）2ul，正反引物各0.5ul，Taq酶0.2ul，其它用水补齐。
请高手指点，我以前没有做过PCR，没经验~

[ Last edited by 350784478 on 2009-11-2 at 12:11 ]
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我是笨笨鱼~~~
1楼 2008-11-18 22:21:15
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boouy

银虫 (正式写手)
深有同感啊，用pfu扩2.8kb的启动子没有进展。欢迎交流。
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2楼2008-11-19 10:11:10
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bbyu007

木虫 (正式写手)
正在纯化模板~~~~~~~~~~~逐步排除吧，没办法的事情~~哎~~~
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我是笨笨鱼~~~
3楼2008-11-19 10:25:12
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gxsulong

至尊木虫 (著名写手)
适当降低退火温度和延长延伸时间看看，再有你的模板不要反复冻融，最好把你近段时间要用到的量放在4度冰箱保存。我原来也有这方面的问题，现在基本解决了。祝好运。
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霉菌
4楼2008-11-19 11:03:02
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bbyu007

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by gxsulong at 2008-11-19 11:03:
适当降低退火温度和延长延伸时间看看，再有你的模板不要反复冻融，最好把你近段时间要用到的量放在4度冰箱保存。我原来也有这方面的问题，现在基本解决了。祝好运。

谢谢您的答疑~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~
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我是笨笨鱼~~~
5楼2008-11-19 15:28:35
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断弦的琴

铁虫 (小有名气)
看下引物的序列 是否正确。。。。
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不知道失去了多少以后我们能不再痛苦,不知道偿多少冷暖以后我们能看破生命.
6楼2008-11-19 15:47:16
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bbyu007

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 断弦的琴 at 2008-11-19 15:47:
看下引物的序列 是否正确。。。。

正在送往各个师兄处检查！！！！！！！
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我是笨笨鱼~~~
7楼2008-11-19 17:01:00
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bioxy

木虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by boouy at 2008-11-19 10:11:
深有同感啊，用pfu扩2.8kb的启动子没有进展。欢迎交流。

用Pfu扩增片段最好不要大于2kb，实在要扩，可以在里面稍微加点Taq酶。
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8楼2008-11-19 17:46:35
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bbyu007

木虫 (正式写手)
纯化模板+不加DMSO+更换dd水=P出来了！！！！！！
正在用高保真酶re  P！~~~~~~~~~~
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我是笨笨鱼~~~
9楼2008-11-19 18:58:41
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boouy

银虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by bioxy at 2008-11-19 17:46:

用Pfu扩增片段最好不要大于2kb，实在要扩，可以在里面稍微加点Taq酶。

最长扩增出过6.1kb片段，这次感觉模板不寻常，不知道是不是启动子GC含量太低（通常30－35％），加上片段有点长（我以前扩启动子通常在1.5-2kb）。

改用68度延伸6min，仍然什么也没有。
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10楼2008-11-20 08:32:36
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