应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 【急】求助：我的PCR总是扩不出来~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~
111/2返回列表12下一页
查看: 805  |  回复: 10
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前主题已经存档。

bbyu007

木虫 (正式写手)

[交流] 【急】求助：我的PCR总是扩不出来~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~

这几天一直在做PCR，目的是扩水稻中某个基因的启动子序列。根据此基因前面2k序列设计引物，模板是水稻日本晴的全基因组DNA，但是一直扩不出来（检测时除了前面有引物二聚体带以外，什么都没有）！！！下午有做了不同退火温度的梯度试验，也是什么都没有！！！
体系是20ul：模板2ul，DNTP2ul，buffer（含mg+2）2ul，正反引物各0.5ul，Taq酶0.2ul，其它用水补齐。
请高手指点，我以前没有做过PCR，没经验~

[ Last edited by 350784478 on 2009-11-2 at 12:11 ]
回复此楼

» 猜你喜欢
我是笨笨鱼~~~
1楼 2008-11-18 22:21:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

boouy

银虫 (正式写手)
深有同感啊，用pfu扩2.8kb的启动子没有进展。欢迎交流。
赞一下 回复此楼
2楼2008-11-19 10:11:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

bbyu007

木虫 (正式写手)
正在纯化模板~~~~~~~~~~~逐步排除吧，没办法的事情~~哎~~~
赞一下 回复此楼
我是笨笨鱼~~~
3楼2008-11-19 10:25:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gxsulong

至尊木虫 (著名写手)
适当降低退火温度和延长延伸时间看看，再有你的模板不要反复冻融，最好把你近段时间要用到的量放在4度冰箱保存。我原来也有这方面的问题，现在基本解决了。祝好运。
赞一下 回复此楼
霉菌
4楼2008-11-19 11:03:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

bbyu007

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by gxsulong at 2008-11-19 11:03:
适当降低退火温度和延长延伸时间看看，再有你的模板不要反复冻融，最好把你近段时间要用到的量放在4度冰箱保存。我原来也有这方面的问题，现在基本解决了。祝好运。

谢谢您的答疑~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~
赞一下 回复此楼
我是笨笨鱼~~~
5楼2008-11-19 15:28:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

断弦的琴

铁虫 (小有名气)
看下引物的序列 是否正确。。。。
赞一下 回复此楼
不知道失去了多少以后我们能不再痛苦,不知道偿多少冷暖以后我们能看破生命.
6楼2008-11-19 15:47:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

bbyu007

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 断弦的琴 at 2008-11-19 15:47:
看下引物的序列 是否正确。。。。

正在送往各个师兄处检查！！！！！！！
赞一下 回复此楼
我是笨笨鱼~~~
7楼2008-11-19 17:01:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

bioxy

木虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by boouy at 2008-11-19 10:11:
深有同感啊，用pfu扩2.8kb的启动子没有进展。欢迎交流。

用Pfu扩增片段最好不要大于2kb，实在要扩，可以在里面稍微加点Taq酶。
赞一下 回复此楼
8楼2008-11-19 17:46:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

bbyu007

木虫 (正式写手)
纯化模板+不加DMSO+更换dd水=P出来了！！！！！！
正在用高保真酶re  P！~~~~~~~~~~
赞一下 回复此楼
我是笨笨鱼~~~
9楼2008-11-19 18:58:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

boouy

银虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by bioxy at 2008-11-19 17:46:

用Pfu扩增片段最好不要大于2kb，实在要扩，可以在里面稍微加点Taq酶。

最长扩增出过6.1kb片段，这次感觉模板不寻常，不知道是不是启动子GC含量太低（通常30－35％），加上片段有点长（我以前扩启动子通常在1.5-2kb）。

改用68度延伸6min，仍然什么也没有。
赞一下 回复此楼
10楼2008-11-20 08:32:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 bbyu007 的主题更新
111/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 325求调剂 +3 Aoyijiang 2026-03-23 3/150 2026-03-26 20:46 by 不吃魚的貓
[考研] 复试调剂，一志愿南农083200食品科学与工程 +3 XQTJZ 2026-03-26 3/150 2026-03-26 20:17 by barlinike
[考研] 0703化学求调剂 +3 丹青奶盖 2026-03-26 5/250 2026-03-26 20:11 by macy2011
[考研] 07化学280分求调剂 +8 722865 2026-03-23 8/400 2026-03-26 20:00 by 不吃魚的貓
[考研] 材料调剂 5+4 想要一壶桃花水 2026-03-25 10/500 2026-03-26 19:56 by 不吃魚的貓
[考研] 0703化学/290求调剂/本科经历丰富/工科也可 +7 丹青奶盖 2026-03-26 7/350 2026-03-26 19:18 by macy2011
[考研] 一志愿北京化工大学材料与化工（085600）296求调剂 +9 稻妻小编 2026-03-26 9/450 2026-03-26 16:16 by 不吃魚的貓
[考研] 北科281学硕材料求调剂 +17 tcxiaoxx 2026-03-20 19/950 2026-03-26 16:04 by 不吃魚的貓
[考研] 材料与化工考研调剂 +10 孅華 2026-03-22 10/500 2026-03-26 15:40 by zzll406
[考研] 环境专硕324分求调剂推荐 +5 轩小宁—— 2026-03-26 5/250 2026-03-26 12:05 by i_cooler
[考研] 085600 材料与化工 329分求调剂 +9 Mr. Z 2026-03-25 9/450 2026-03-26 10:36 by baoball
[考研] 333求调剂 +6 87639 2026-03-21 11/550 2026-03-25 16:17 by 87639
[考研] 各位老师您好：本人初试372分 +5 jj涌77 2026-03-25 6/300 2026-03-25 14:15 by mapenggao
[考研] 293求调剂 +7 加一一九 2026-03-24 7/350 2026-03-25 12:02 by userper
[考研] 333求调剂 +3 ALULU4408 2026-03-23 3/150 2026-03-23 19:04 by macy2011
[考研] 328求调剂 +4 LHHL66 2026-03-23 4/200 2026-03-23 14:55 by lbsjt
[考研] 一志愿华中科技大学071000，求调剂 +4 沿岸有贝壳6 2026-03-21 4/200 2026-03-22 07:21 by ilovexiaobin
[考研] 材料学硕301分求调剂 +7 Liyouyumairs 2026-03-21 7/350 2026-03-21 22:31 by peike
[考研] 考研调剂 +3 呼呼？~+123456 2026-03-21 3/150 2026-03-21 20:04 by 无际的草原
[考研] 一志愿南大，0703化学，分数336，求调剂 +3 收到VS 2026-03-21 3/150 2026-03-21 18:42 by 学员8dgXkO
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭