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proteinwang铜虫 (正式写手)
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连接出了怪现象！
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各位大虾好，最进进行了2批连接试验，但是结果有点怪，描述一下，大家帮忙看看出了什么问题哦! 质粒载体为pUC18（2.68kb），目的片段为0.9kb（为一抗生素基因），采用单酶切HindⅢ。 puc18和目的片段37度条件下酶切6h，酶切体系按照说明书配制，酶切后对puc18进行了电泳检测，其得到了很好的酶切。目的片段因为酶切下来的片段较小，无法验证酶切结果。 目的片段，试剂盒回收，puc18经80度20min失活内切酶后直接用于连接。 按照T4 DNA连接酶说明操作，过夜连接。CaCl2法转化。因为我的目的片段是一个抗性基因，在含有相应抗生物的平板上筛选到了转化子。 公得到9各转化子，提取质粒DNA，HindⅢ酶切，电泳验证。结果只切出了一条带，条带长度为8Kb。按照推断HindⅢ酶切后应该得到pUC18片段和目的片段为0.9kb，但是却得到了这么大的片段。 利用转化子质粒为模板进行pcR扩增还得到了我的目的片段。 这真是怪了！！ 请大家帮忙分析一下原因吧，谢谢！ 另外，单酶切进行连接时必须进行去磷酸化处理吗？应该怎样操作才能得到比较高的连接和转化效率呢？ |
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