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静默人声412

木虫 (小有名气)

[求助] 提取土壤DNA,DNA电泳有条带,就是PCR结果不出条带 已有3人参与

用氨氧化细菌特异性引物,amoA_1F,amoA-2R,
扩增氨氧化细菌amoA基因,但是扩不出来,没有结果。
      我使用的宝生物的冷启动taq酶 ,每个反应体系加0.25ul酶,0.4ul引物,五个反应体系融合后,再分装,依据taq酶说明书设计的PCR反应过程,98,10s;55,30s,721min.40个循环。
哪位大神能帮我分析一下!
之前引物是每个2ul,引物二聚体过多,后稀释5倍。

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hanxiaominhu

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-08-07 14:53:36
退火温度和延伸时间是要看你用的引物的。其它主要看PCR酶。普通PCR的引物浓度大部分都是一致的,没记错的话差不多0.2uM。
2楼2016-08-07 08:58:04
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取个什么名啊

木虫 (正式写手)


xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-08-07 14:53:42
土壤dna提取出来你纯化了吗?里面可能含有腐殖酸,会影响pcr。

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3楼2016-08-07 12:09:10
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独爱华尔兹

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖


西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-08-09 07:45:00
可能是DNA有问题:1.用专门提取土壤DNA的试剂盒提取DNA;2. DNA纯化;3. DNA在做PCR前稀释

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

4楼2016-08-08 12:42:51
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静默人声412

木虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 取个什么名啊 at 2016-08-07 12:09:10
土壤dna提取出来你纯化了吗?里面可能含有腐殖酸,会影响pcr。

我用的专门的土壤基因组提取试剂盒,也要纯化吗?

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5楼2016-08-08 13:12:11
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295249857

新虫 (初入文坛)

土壤DNA一般提取出来含抑制剂教多,最好稀释下再做模板。
6楼2016-08-08 14:38:25
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取个什么名啊

木虫 (正式写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 静默人声412 at 2016-08-08 13:12:11
我用的专门的土壤基因组提取试剂盒,也要纯化吗?
...

最好还是纯化下

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7楼2016-08-08 15:19:42
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静默人声412

木虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 295249857 at 2016-08-08 14:38:25
土壤DNA一般提取出来含抑制剂教多,最好稀释下再做模板。

我稀释了五倍,跑PCR,只有引物二聚体

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8楼2016-08-08 16:46:57
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yuhan131481

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

土壤提取的DNA抑制物太多,建议:1、用DNA磁珠纯化下;2、可以试下NEB的 Q5或者Kapa hifi热启动酶,这两个酶耐受性比较强。谢谢
9楼2016-08-08 17:42:43
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books

木虫 (小有名气)

加dmso,或许出来了

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» 本帖已获得的红花(最新10朵)

10楼2016-08-08 20:03:34
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