| 查看: 4611 | 回复: 15 | ||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||
乌托小邦木虫 (正式写手)
小虫虫
|
[求助]
关于Cas9-sgRNA构建的困惑，质粒一直提不出来，向大家求助！！
|
|
|
最近在试着做Cas9，想敲掉一个基因，选择了六个靶点。其中四个sgRNA很顺利就连进Cas9载体了，但是有两个靶点的sgRNA死活弄不出来，退火-连接-转化-挑斑-菌液PCR都没有问题（菌液PCR100%正确），然后我就抽提质粒送去测序。 1）测序公司告诉我质粒电泳没有条带，一片模糊； 2）我就自己也跑了电泳，确实永远都是一片模糊的； 3）然后我就怀疑是不是质粒抽提试剂盒坏了，我就直接拿菌液送去测序，测序公司（两家）也说抽提不出来质粒； 4）但是我拿菌液划线，是能正常长斑的； 5）抽提的质粒重新转化却啥也没长； 6）换了一家合成引物的公司，重新合成引物，结果依旧； 7）已经做了三次了，抽提试剂盒也换了新的，都是这样的，问题到底出在哪里呢？有这方面经验的大神能指点一下不？ 我用的这个载体是14kb，是因为载体太大吗？如果是这个原因的话，为什么另外四个很顺利成功呢？ 关于Cas9技术，我今年刚接触，不是太懂，异想天开一下：会不会是这两个靶点跟component cell里的某个基因匹配，cas9在component cell里发生切割作用了？（我也不知道这个时候Cas9是否能发挥作用，实在是想不出问题在哪，瞎猜的。。） 求帮助，求指点！ |
回复此楼» 猜你喜欢
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有236人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
-
留学--博士招生
已经有14人回复
-
化学工程，本211，求调剂，ab区不限
已经有4人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
12楼2016-10-10 17:17:03
yunsmile2016
新虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 265.3
- 散金: 90
- 红花: 2
- 帖子: 163
- 在线: 15.8小时
- 虫号: 4863857
- 注册: 2016-07-23
- 专业: 组织工程与再生医学
2楼2016-08-03 23:13:55
3楼2016-08-06 00:32:08
不吃M的鱼
金虫 (小有名气)
- 应助: 1 (幼儿园)
- 金币: 2134.6
- 红花: 1
- 帖子: 78
- 在线: 17.4小时
- 虫号: 1646205
- 注册: 2012-02-27
- 性别: GG
- 专业: 生物物理、生物化学与分子
4楼2016-08-06 08:02:57
20