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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 预实验可以P出目地条带，之后就再P不出来
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强子_2013

新虫 (小有名气)

[求助] 预实验可以P出目地条带，之后就再P不出来 已有2人参与

用的LA酶，20ul体系，模版是cDNA
预变性94℃ 2min，变性 94℃ 30S ，72℃延伸2min，退火55、58、61三个梯度。35个循环
这是我第一次PCR预实验的结果，第一个和最后一个之后再没有P出来，不论是20ul还是50ul体系。一直找不到原因。
引物是小导合成的，说是最优化了了。。。。有大神帮我分析下吧，
或者是换体系，还是什么的。。。。
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1楼 2016-08-02 17:37:17
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强子_2013

新虫 (小有名气)
为什么 图上传不上去？
赞一下 回复此楼
2楼2016-08-02 17:56:57
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

maoxixi

新虫 (初入文坛)
★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-08-03 07:31:57
把酶量加倍试试

发自小木虫Android客户端
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3楼2016-08-02 21:41:19
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Alice 2016

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
预实验能够做出来，可以考虑是否模板、引物、酶降解了，另外可根据你的引物Tm值设计退火温度，可以多做几个退火温度梯度。
赞一下(1人) 回复此楼
怕什么真理无穷，进一寸有一寸的欢喜
4楼2016-08-04 11:01:16
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科技小达人

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
重新提RNA反转录下试试，我以前就是模板出的问题
赞一下 回复此楼
林木遗传育种
5楼2016-08-04 17:50:26
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强子_2013

新虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 科技小达人 at 2016-08-04 17:50:26
重新提RNA反转录下试试，我以前就是模板出的问题

好的，多谢，这两天试一试
赞一下 回复此楼
6楼2016-08-05 17:13:37
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强子_2013

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by Alice 2016 at 2016-08-04 11:01:16
预实验能够做出来，可以考虑是否模板、引物、酶降解了，另外可根据你的引物Tm值设计退火温度，可以多做几个退火温度梯度。

退火温度 从44一直P到65
考虑再重新提RNA做下。 多谢
赞一下 回复此楼
7楼2016-08-05 17:15:17
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强子_2013

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by maoxixi at 2016-08-02 21:41:19
把酶量加倍试试

试了，还是不行
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8楼2016-08-08 09:12:27
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