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强子_2013

新虫 (小有名气)

[求助] 预实验可以P出目地条带,之后就再P不出来 已有2人参与

用的LA酶,20ul体系,模版是cDNA
预变性94℃ 2min,变性 94℃ 30S ,72℃延伸2min,退火55、58、61三个梯度。35个循环
这是我第一次PCR预实验的结果,第一个和最后一个之后再没有P出来,不论是20ul还是50ul体系。一直找不到原因。
引物是小导合成的,说是最优化了了。。。。有大神帮我分析下吧,
或者是换体系,还是什么的。。。。
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强子_2013

新虫 (小有名气)

为什么 图上传不上去?
2楼2016-08-02 17:56:57
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maoxixi

新虫 (初入文坛)


xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-08-03 07:31:57
把酶量加倍试试

发自小木虫Android客户端
3楼2016-08-02 21:41:19
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Alice 2016

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
预实验能够做出来,可以考虑是否模板、引物、酶降解了,另外可根据你的引物Tm值设计退火温度,可以多做几个退火温度梯度。
怕什么真理无穷,进一寸有一寸的欢喜
4楼2016-08-04 11:01:16
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科技小达人

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
重新提RNA反转录下试试,我以前就是模板出的问题
林木遗传育种
5楼2016-08-04 17:50:26
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强子_2013

新虫 (小有名气)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 科技小达人 at 2016-08-04 17:50:26
重新提RNA反转录下试试,我以前就是模板出的问题

好的,多谢,这两天试一试
6楼2016-08-05 17:13:37
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强子_2013

新虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by Alice 2016 at 2016-08-04 11:01:16
预实验能够做出来,可以考虑是否模板、引物、酶降解了,另外可根据你的引物Tm值设计退火温度,可以多做几个退火温度梯度。

退火温度 从44一直P到65
考虑再重新提RNA做下。 多谢
7楼2016-08-05 17:15:17
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强子_2013

新虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by maoxixi at 2016-08-02 21:41:19
把酶量加倍试试

试了,还是不行
8楼2016-08-08 09:12:27
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