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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 荧光定量PCR老是批出阴性对照，帮分析一下
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kd22309

金虫 (小有名气)

[交流] 荧光定量PCR老是批出阴性对照，帮分析一下

我最近一直用SYBR Green 1 做RT-PCR，前两天做了一次，阴性对照就批出来了，我当时以为是水，引物或者MIX中的一个被污染了，然后今天就把上面的所有的东西都换了新的，今天还是又批出阴性对照了，我实在是找不到原因了，有没有经验的高手告诉我，我还应该注意些什么.谢谢

[ Last edited by 350784478 on 2009-11-3 at 15:24 ]
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1楼 2008-11-13 20:18:33
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香菱儿

铁杆木虫 (著名写手)
★
kd22309(金币+1,VIP+0): 8-21 17:38
重新设计引物吧
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漫洒英雄泪，相离处士家。谢慈悲剃度在莲台下。没缘法转眼分离乍。赤条条来去无牵挂。那里讨烟蓑雨笠卷单行？一任俺芒鞋破钵随缘化！
2楼2008-11-15 10:23:34
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lifei-fei

金虫 (著名写手)

伊丽莎白
★ ★
司马诸葛(金币+1,VIP+0):谢谢交流 8-17 10:20
kd22309(金币+1,VIP+0): 8-21 17:38
肯定是污染了！极可能是引物污染，重新合成吧！

你怎么知道阴性对照扩增出条带，你把反应后的样跑电泳了吗？
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做有意义的事就是好好活着！
3楼2008-11-15 11:15:38
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bio-engine

银虫 (小有名气)
★
司马诸葛(金币+1,VIP+0):谢谢交流 8-17 10:22
可能是引物对问题，建议重新设计引物
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4楼2008-11-15 16:59:04
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skkyy88888

铜虫 (著名写手)
一种气融胶污染
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5楼2008-11-15 20:37:25
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petitella

银虫 (初入文坛)
★ ★
司马诸葛(金币+2,VIP+0):谢谢交流 8-17 10:21
你做的是什么？ SYBR Green这个方法本来就背景高，如果用的是TAKARA的KIT，那是背景比较高，光看Ct值确实不好辨别。排除污染问题后，建议还是看一下熔点曲线和熔点温度吧，引物熔点和目的序列的熔点是不同的。
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6楼2008-11-15 21:59:43
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prettymuch

★
司马诸葛(金币+1,VIP+0):谢谢交流 8-17 10:21
气溶胶污染或引物污染
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7楼2008-11-21 15:22:49
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棋宴

新虫 (初入文坛)
我之前做巢式PCR，阴性对照也一直出条带
最后才发现是酶的问题
换了酶就好了
现在阴性对照就没条带了
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8楼2008-11-24 22:48:54
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kd22309

金虫 (小有名气)

谢谢各位了

谢谢各位了，原因已经找到了，就是引物污染了，重新合成引物阴性就没有批出了。
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9楼2008-12-04 13:39:54
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