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禾口王

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[交流] [实验技术] RT-PCR试验体会

一点心得，希望有点小用

RT-PCR试验体会
1. RT-PCR的原理和实验步骤
主要有三步：抽提RNA，RT，PCR。
需要注意的是（1）做RT前必需测RNA浓度，（2） RT按要求做，一般不会出太大问题。（3）PCR，按常规。但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。
2 引物设计
重点讲了引物设计一定要先知道目的基因的序列。在RT时，引物设计有3种方法即a：Random 9mers；b：Oligo dT-Adaptor Primer；和c：特异的下游引物。如果用a和b方法，是扩增的所有的cDNA，还要用此产物做PCR 的模板继续扩增。如果用c方法，那么可以去这里查它的序列：http://www.ncbi.nlm.nih.gov
3、RT-PCR有两种做法：
一是用kit进行一步法进行；二是分两步进行逆转录再PCR。一般是是两步法进行，结果更加理想，条带特异性强且无拖尾现象，推测是体系更加单一比较利于PCR的进行。
4、RT-PCR应具备的条件：
高质量的RNA；引物的（最好产物短点）；若涉及粗略定量的话还应考虑RNA的浓度或是cDNA的浓度；体系的均一性等。
5、RT-PCR内参照
可以在一个管子里做（，最好分开两管，把除了引物之外的mixture统一配，拍照后，算目的基因和内参的比值，这就是基因表达的相对浓度。在同一管中做RT，其实没有什么问题，不需要taq酶加量，taq酶本来就是过量的。Mg就更不能变了，一变整个体系就变了。能看到均一条带就很好了。
6、关于引物设计
除了常规要求之外，最好兼顾跨内含子（不过，根据要求，还可以专门设计隔内含子的，这样还可以用于基因组PCR）、长度小于500bp－600bp等等。引物要设计成一样的退火温度.
7、所有RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。在实验中，一方面要严格控制外源性RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶。RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。在其它分子生物学实验中使用的RNA酶也会造成污染。这些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶。
8、防止RNA酶污染的措施
1）所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。
2）塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗.
3）配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。
4）操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。
9、如何确认RNA的质量：
1）检测RNA溶液的吸光度
2)RNA的电泳图谱
一般的，RNA的电泳都是用变性胶进行的，如果你\仅仅是为了检测RNA的质量是没有必要进行如此麻烦的实验的，用普通的琼脂糖胶就可以了。
3)保温试验：可以确认RNA溶液中有没有残留的RNA酶的方法

[ Last edited by 禾口王 on 2008-11-12 at 09:38 ]

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