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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 如何评价引物的特异性？
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大东红日

木虫 (正式写手)

[求助] 如何评价引物的特异性？ 已有1人参与

已经使用oligo进行打分，筛选出的引物并不能肯定是针对特定基因扩增，然后用primer－blast分析引物，跑出的结果并没有我想要的物种，请问该如何确定手上的引物特异性好？
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1楼 2016-07-19 22:10:39
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jerry0571

新虫 (初入文坛)
样品很杂，里面含有多个物种?

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2楼2016-07-20 05:37:12
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jerry0571

新虫 (初入文坛)
★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-07-20 06:43:08
我觉得如果样品中含有近似物种，可以先比对下目的基因序列，选择物种间有差异的序列设计引物

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3楼2016-07-20 05:41:38
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jerry0571

新虫 (初入文坛)
★
xn8008: 金币+1, 欢迎发帖交流 2016-07-20 06:43:20
另外可以在Pubmed里primer blast检测时取消背景基因组的限制，看看可能被扩增的序列

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4楼2016-07-20 05:47:35
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大东红日

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by jerry0571 at 2016-07-20 05:37:12
样品很杂，里面含有多个物种?

我找的引物是用来扩增硅藻的特异性片段，样品是溺死人体的肺，肝、肾组织提取到的总DNA，我现在想要确定找到的引物是否能扩增出目的硅藻的目标基因，在primer－blast的结果中有藻类但不是硅藻
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5楼2016-07-20 14:16:03
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
5楼: Originally posted by 大东红日 at 2016-07-20 14:16:03
我找的引物是用来扩增硅藻的特异性片段，样品是溺死人体的肺，肝、肾组织提取到的总DNA，我现在想要确定找到的引物是否能扩增出目的硅藻的目标基因，在primer－blast的结果中有藻类但不是硅藻...

确定NCBI数据库里有硅藻的该序列吗？如果有，应该是能匹配上的。
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6楼2016-07-20 19:09:01
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大东红日

木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by stone2239 at 2016-07-20 19:09:01
确定NCBI数据库里有硅藻的该序列吗？如果有，应该是能匹配上的。...

有，但是只有一些基因片段，照道理文献中的引物扩增的目的基因片段应该可以在ncbi通过blast找到啊，但是我通过blast找到的虽然是藻类，但是不是硅藻类，听师兄说如果不能确定一对引物的特异性的优点，盲目去做实验，检验一对要花近两个月的时间。所以我现在想知道该怎么确定引物对我的目标藻类的特异性如何
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7楼2016-07-20 21:15:36
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

blast时把物种限定为硅藻试一下。或者直接用硅藻DNA做模板扩增，看是否有条带，有带拿去测序看下是不是你要的。
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8楼2016-07-21 00:03:33
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houfuyuan

新虫 (小有名气)
这样的话，你这引物十之八九跟模板序列不匹配啊，引物设计很有问题了。重新找模板序列设计吧。先不管特异性，你得先有自己的目的物种吧。
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玉无瑕，青春无华。
9楼2016-07-23 19:59:14
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大东红日

木虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by houfuyuan at 2016-07-23 19:59:14
这样的话，你这引物十之八九跟模板序列不匹配啊，引物设计很有问题了。重新找模板序列设计吧。先不管特异性，你得先有自己的目的物种吧。

我是从文献中找到的引物，想要验证是否能扩增出文献中目标物种的特异性片段。

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10楼2016-07-23 23:31:00
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