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颜料

银虫 (正式写手)

[求助] 蛋白纯化 已有2人参与

我做蛋白纯化的时候第一次过DEAE弱阴离子交换柱得到的图谱是这样的，酶活分布得比较散，在两个高峰之间，有没有什么好的办法把，两个三个峰分开点呢？是不是我进样浓度太大了？

蛋白纯化


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那些优秀的都那么努力，我有什么理由不努力。
1楼 2016-07-13 09:54:15
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sspxiaoji

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
颜料(星海慧儿代发): 金币+2, 非常感谢回帖参与交流 2016-08-23 13:47:40
你的条件讲的很不清楚。比如梯度，载量，填料型号等信息。所以不好回答。根据经验，DEAE制备想取得你想要的把三个峰分开的效果，难度比较大，需要大量优化。建议重点考虑更换为强阳离子柱，降低载量，并选择细颗粒的填料。
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2楼2016-07-13 10:41:23
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颜料

银虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by sspxiaoji at 2016-07-13 10:41:23
你的条件讲的很不清楚。比如梯度，载量，填料型号等信息。所以不好回答。根据经验，DEAE制备想取得你想要的把三个峰分开的效果，难度比较大，需要大量优化。建议重点考虑更换为强阳离子柱，降低载量，并选择细颗粒的 ...

我用的是180mL,DEAD-Spharose-FF的柱子，进样量9mL,采用梯度洗脱，浓度0~100，洗脱的时候洗脱两个柱体积。

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那些优秀的都那么努力，我有什么理由不努力。
3楼2016-07-13 12:45:37
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sspxiaoji

银虫 (正式写手)
★ ★
颜料(星海慧儿代发): 金币+2, 非常感谢回帖参与交流 2016-08-23 13:47:55
引用回帖:
3楼: Originally posted by 颜料 at 2016-07-13 12:45:37
我用的是180mL,DEAD-Spharose-FF的柱子，进样量9mL,采用梯度洗脱，浓度0~100，洗脱的时候洗脱两个柱体积。
...

1、FF的颗粒很大，它的定位就是用于初纯。可以考虑High performence系列的。2、50%B每CV的梯度太急了，从图上看你走FF的速度是不是很慢，这个可是高流速的填料，用这么小的流速不合理，所以可以考虑加大流速，放缓梯度。3、你的蛋白量有多少？感觉180ml的柱子进9ml的量是否太低了？
另外从图上看，以你现在的条件就能分到三个包。说明这三个成分的电荷差异还是很大的。做到你想要分离效果还是很有希望的。
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4楼2016-07-14 08:14:12
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颜料

银虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by sspxiaoji at 2016-07-14 08:14:12
1、FF的颗粒很大，它的定位就是用于初纯。可以考虑High performence系列的。2、50%B每CV的梯度太急了，从图上看你走FF的速度是不是很慢，这个可是高流速的填料，用这么小的流速不合理，所以可以考虑加大流速，放缓 ...

这是我第二次跑的，流速是3mL/min,因为我们的柱子，低压柱如果加大流速的话柱子的上部会顶上来。这次剃度洗脱的速度减慢了，洗脱了四个柱体积。进样量和峰型有什么关系？进样太少会怎么样？
蛋白纯化-1



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那些优秀的都那么努力，我有什么理由不努力。
5楼2016-07-15 09:52:05
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熙扬502

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
颜料(星海慧儿代发): 金币+1, 非常感谢回帖参与交流 2016-08-23 13:48:04
颜料: 金币+15, ★★★很有帮助 2016-08-28 17:38:27
是不是可以考虑继续增大洗脱体积，同时将洗脱液浓度范围缩小为30~100，三个组分分辨率较好后，再用各峰对应的洗脱液浓度进行三步等梯度洗脱，这样三个峰就会分得比较开。
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去经历吧!
6楼2016-08-23 11:04:40
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