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生物界菜鸟

新虫 (初入文坛)

[求助] 流感病毒HA,NA测序问题(菜鸟倾尽金币求助~~~)

菜鸟我生物本科学历,今年6月初开始的测定流感病毒HA,NA的序列工作。因之前专门到做此试验的专业部门去学习过,试剂盒都按学习时采购的。我们的大概流程是:病毒总RNA的提取,反转录,cDNA扩增(PCR),电泳鉴定。。。。。。为什么至写到这里,因为只做到这,就遇到问题,无法向下开展了。
问题:
总的问题:没有得到目的条带(HA:1700bp,NA:1400bp)
提取RNA是用试剂盒提取的,提取后进行RNA电泳得到如下条带: \"流感病毒HA,NA测序问题(菜鸟倾尽金币求助~~~)\"
而后进行RTPCR,PCR扩增后进行DNA电泳得到如下条带: \"流感病毒HA,NA测序问题(菜鸟倾尽金币求助~~~)-1\"
如图所示,并没有得到我们想要的1400bp和1700bp的条带。
而后我多次调整退火温度,甚至更换新的引物(学习时,相同毒种可以P出来的引物),都没有得到目的条带。菜鸟我实在分析不出原因,现倾尽菜鸟的金币(虽然也少得可怜)求助大神予以指导~~~
此外,菜鸟还有些问题求助大神们:
问题1:学习时测序所用流感毒种取自于鸡胚尿囊液,现在所测毒种为细胞培养增值的流感病毒,二者在RNA提取的过程中是否应有所不同?
问题2:≤250bp甚至<100bp片段的出现大多由什么原因引起?引物二聚体?还是引物特异性不好呢?还是有别的什么原因?
请各位大神不吝指导,拜托了!!!
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