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生物界菜鸟

新虫 (初入文坛)

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专业: 微生物学

[求助] 流感病毒HA，NA测序问题（菜鸟倾尽金币求助~~~）

菜鸟我生物本科学历，今年6月初开始的测定流感病毒HA，NA的序列工作。因之前专门到做此试验的专业部门去学习过，试剂盒都按学习时采购的。我们的大概流程是：病毒总RNA的提取，反转录，cDNA扩增（PCR），电泳鉴定。。。。。。为什么至写到这里，因为只做到这，就遇到问题，无法向下开展了。
问题：
总的问题：没有得到目的条带（HA：1700bp，NA：1400bp）
提取RNA是用试剂盒提取的，提取后进行RNA电泳得到如下条带： $\"流感病毒HA，NA测序问题（菜鸟倾尽金币求助~~~）\"$
而后进行RTPCR，PCR扩增后进行DNA电泳得到如下条带： $\"流感病毒HA，NA测序问题（菜鸟倾尽金币求助~~~）-1\"$
如图所示，并没有得到我们想要的1400bp和1700bp的条带。
而后我多次调整退火温度，甚至更换新的引物（学习时，相同毒种可以P出来的引物），都没有得到目的条带。菜鸟我实在分析不出原因，现倾尽菜鸟的金币（虽然也少得可怜

）求助大神予以指导~~~
此外，菜鸟还有些问题求助大神们：
问题1：学习时测序所用流感毒种取自于鸡胚尿囊液，现在所测毒种为细胞培养增值的流感病毒，二者在RNA提取的过程中是否应有所不同？
问题2：≤250bp甚至＜100bp片段的出现大多由什么原因引起？引物二聚体？还是引物特异性不好呢？还是有别的什么原因?
请各位大神不吝指导，拜托了！！！

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1楼 2016-07-05 10:55:10

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