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[求助]
流感病毒HA，NA测序问题（菜鸟倾尽金币求助~~~）
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菜鸟我生物本科学历，今年6月初开始的测定流感病毒HA，NA的序列工作。因之前专门到做此试验的专业部门去学习过，试剂盒都按学习时采购的。我们的大概流程是：病毒总RNA的提取，反转录，cDNA扩增（PCR），电泳鉴定。。。。。。为什么至写到这里，因为只做到这，就遇到问题，无法向下开展了。 问题： 总的问题：没有得到目的条带（HA：1700bp，NA：1400bp） 提取RNA是用试剂盒提取的，提取后进行RNA电泳得到如下条带： ![\"流感病毒HA，NA测序问题（菜鸟倾尽金币求助~~~）\"](\"https://muchongimg.xmcimg.com/data/bcs/2016/0705/w145h3387723_1467686072_457.png#opennewwindow\") 而后进行RTPCR，PCR扩增后进行DNA电泳得到如下条带： ![\"流感病毒HA，NA测序问题（菜鸟倾尽金币求助~~~）-1\"](\"https://muchongimg.xmcimg.com/data/bcs/2016/0705/w139h3387723_1467686150_413.png#opennewwindow\") 如图所示，并没有得到我们想要的1400bp和1700bp的条带。 而后我多次调整退火温度，甚至更换新的引物（学习时，相同毒种可以P出来的引物），都没有得到目的条带。菜鸟我实在分析不出原因，现倾尽菜鸟的金币（虽然也少得可怜  ）求助大神予以指导~~~此外，菜鸟还有些问题求助大神们： 问题1：学习时测序所用流感毒种取自于鸡胚尿囊液，现在所测毒种为细胞培养增值的流感病毒，二者在RNA提取的过程中是否应有所不同？ 问题2：≤250bp甚至＜100bp片段的出现大多由什么原因引起？引物二聚体？还是引物特异性不好呢？还是有别的什么原因? 请各位大神不吝指导，拜托了！！！ |
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