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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 换载后，GFP就不表达了
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gstracy

新虫 (初入文坛)

[交流] 换载后，GFP就不表达了 已有5人参与

先构建pEGFP-A（A是我克隆的基因），含重组子的DH5a有绿色荧光。
然后再换载，把A-GFP切下来克隆到另一个载体上，测序无误，但是TOP10没有荧光。
换载前是有荧光的，应该不是移码突变。
求解。
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1楼 2016-06-26 19:52:33
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kaobo2012

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我也遇到类似的问题。应该是你这个基因，不适合在这个载体上表达。
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2楼2016-06-26 22:02:27
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张凡云

至尊木虫 (职业作家)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2016-06-27 07:42:13
绿色荧光蛋白貌似是单体，你后面融合的那个蛋白，可能对其结构有影响，导致绿色荧光蛋白不能发出荧光，你跑蛋白电泳，应该有目标条带吧？

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3楼2016-06-27 00:19:53
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gstracy

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by kaobo2012 at 2016-06-26 22:02:27
我也遇到类似的问题。应该是你这个基因，不适合在这个载体上表达。

那请问你是怎么解决的呢？换载体？
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4楼2016-06-27 13:40:11
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gstracy

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 张凡云 at 2016-06-27 00:19:53
绿色荧光蛋白貌似是单体，你后面融合的那个蛋白，可能对其结构有影响，导致绿色荧光蛋白不能发出荧光，你跑蛋白电泳，应该有目标条带吧？

我还没有跑蛋白，目的蛋白是融合在GFP前面的。在换载之前还有荧光，说明我的目的蛋白对GFP的表达没有影响吧。
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5楼2016-06-27 13:42:32
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张凡云

至尊木虫 (职业作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你先跑蛋白电泳看看呗，你换个载体之后，启动子就不一样了，如果蛋白电泳结果正确，那就是换载体之后，结构变了

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6楼2016-06-27 13:55:53
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viki_MDK

银虫 (正式写手)
换什么载体了，
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7楼2016-06-27 15:44:08
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gstracy

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by viki_MDK at 2016-06-27 15:44:08
换什么载体了，

不是载体的问题，移码突变了。。。
就是你刚刚回复的另一个帖子
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8楼2016-06-27 16:24:33
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aofeng860308

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你是开始把目的基因放在gfp的后面，后来是目的基因在gfp后面吗？

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9楼2016-06-27 16:30:21
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gstracy

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by aofeng860308 at 2016-06-27 16:30:21
你是开始把目的基因放在gfp的后面，后来是目的基因在gfp后面吗？

没有，目的基因融合在gfp前面的
现在确定是移码突变了，可是换载前是有荧光反应的，奇怪了。。
如果可以的话，能看一下这个帖子吗http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=10438190
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10楼2016-06-27 16:38:39
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