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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 免疫实验 » 免疫沉淀试验操作
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jiafeijiafei

金虫 (小有名气)

[求助] 免疫沉淀试验操作 已有1人参与

大家好，我最近在做IP实验，想纯化目的蛋白，分子量是57KD。但是因为是新手，不是太懂。有几个问题想咨询：
1、抗体的选择：抗体的效价高低对抗原抗体的结合效率有影响吗？还是只单纯考虑抗体的浓度？
2、因为我是要把目的蛋白洗脱下来做液质分析，师兄师姐说我这个蛋白会和抗体的重链分不开，想知道目的蛋白和抗体对质谱分析有影响吗？一定要用交联剂？
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1楼 2016-06-21 21:43:33
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kaobo2012

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
jiafeijiafei(youlinglyw代发): 金币+5, 赠人玫瑰手有余香，生物科学有你更精彩 2016-06-22 20:16:10
1.免疫沉淀实验用的抗体，一般要看亲和力。亲和力太高，不利于洗脱。亲和力太弱，不利于目的蛋白的收集。如果你是买的抗体，就看看说明书，说可以做这个实验，那用就可以了。
2.你质谱，要打完整分子量，还是氨基酸序列？这个要讲清楚，才能回答你的问题。
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2楼2016-06-21 22:02:36
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jiafeijiafei

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by kaobo2012 at 2016-06-21 22:02:36
1.免疫沉淀实验用的抗体，一般要看亲和力。亲和力太高，不利于洗脱。亲和力太弱，不利于目的蛋白的收集。如果你是买的抗体，就看看说明书，说可以做这个实验，那用就可以了。
2.你质谱，要打完整分子量，还是氨基酸 ...

打氨基酸序列，主要是想看翻译后修饰

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3楼2016-06-21 23:59:19
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biocherry

铁虫 (正式写手)
选择不同的抗体，可避免和抗体链重合

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4楼2016-06-22 18:13:36
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jiafeijiafei

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by biocherry at 2016-06-22 18:13:36
选择不同的抗体，可避免和抗体链重合

可是抗体分重链和轻链，重链是55kd，洗脱的话不就重合了么？工程师说可以用交联剂，把抗体交联到磁珠上，这样洗脱的时候抗体就不会和抗原同时洗脱下来。

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5楼2016-06-22 18:56:18
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kaobo2012

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by jiafeijiafei at 2016-06-21 23:59:19
打氨基酸序列，主要是想看翻译后修饰
...

质谱我做的少，不过，我印象当中，要先打完整分子量，从理论上判断有没有修饰（比如糖链的长度，可以算出来的），打氨基酸序列，是要酶解的，如果找到合适的酶，这样就可以确定翻译修饰的具体位点。
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6楼2016-06-22 21:01:16
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jiafeijiafei

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by kaobo2012 at 2016-06-22 21:01:16
质谱我做的少，不过，我印象当中，要先打完整分子量，从理论上判断有没有修饰（比如糖链的长度，可以算出来的），打氨基酸序列，是要酶解的，如果找到合适的酶，这样就可以确定翻译修饰的具体位点。...

对，我现在就是想把蛋白纯化出来，经过酶解等操作把多肽进液质，分析该蛋白有哪些翻译后修饰。后面的操作我都会，现在的问题就是纯化做IP，觉得难做

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7楼2016-06-22 21:03:26
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