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jiafeijiafei

金虫 (小有名气)

[求助] 免疫沉淀试验操作 已有1人参与

大家好,我最近在做IP实验,想纯化目的蛋白,分子量是57KD。但是因为是新手,不是太懂。有几个问题想咨询:
1、抗体的选择:抗体的效价高低对抗原抗体的结合效率有影响吗?还是只单纯考虑抗体的浓度?
2、因为我是要把目的蛋白洗脱下来做液质分析,师兄师姐说我这个蛋白会和抗体的重链分不开,想知道目的蛋白和抗体对质谱分析有影响吗?一定要用交联剂?
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kaobo2012

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
jiafeijiafei(youlinglyw代发): 金币+5, 赠人玫瑰手有余香,生物科学有你更精彩 2016-06-22 20:16:10
1.免疫沉淀实验用的抗体,一般要看亲和力。亲和力太高,不利于洗脱。亲和力太弱,不利于目的蛋白的收集。如果你是买的抗体,就看看说明书,说可以做这个实验,那用就可以了。
2.你质谱,要打完整分子量,还是氨基酸序列?这个要讲清楚,才能回答你的问题。
2楼2016-06-21 22:02:36
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jiafeijiafei

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by kaobo2012 at 2016-06-21 22:02:36
1.免疫沉淀实验用的抗体,一般要看亲和力。亲和力太高,不利于洗脱。亲和力太弱,不利于目的蛋白的收集。如果你是买的抗体,就看看说明书,说可以做这个实验,那用就可以了。
2.你质谱,要打完整分子量,还是氨基酸 ...

打氨基酸序列,主要是想看翻译后修饰

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3楼2016-06-21 23:59:19
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biocherry

铁虫 (正式写手)

选择不同的抗体,可避免和抗体链重合

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4楼2016-06-22 18:13:36
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jiafeijiafei

金虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by biocherry at 2016-06-22 18:13:36
选择不同的抗体,可避免和抗体链重合

可是抗体分重链和轻链,重链是55kd,洗脱的话不就重合了么?工程师说可以用交联剂,把抗体交联到磁珠上,这样洗脱的时候抗体就不会和抗原同时洗脱下来。

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5楼2016-06-22 18:56:18
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kaobo2012

木虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by jiafeijiafei at 2016-06-21 23:59:19
打氨基酸序列,主要是想看翻译后修饰
...

质谱我做的少,不过,我印象当中,要先打完整分子量,从理论上判断有没有修饰(比如糖链的长度,可以算出来的),打氨基酸序列,是要酶解的,如果找到合适的酶,这样就可以确定翻译修饰的具体位点。
6楼2016-06-22 21:01:16
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jiafeijiafei

金虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by kaobo2012 at 2016-06-22 21:01:16
质谱我做的少,不过,我印象当中,要先打完整分子量,从理论上判断有没有修饰(比如糖链的长度,可以算出来的),打氨基酸序列,是要酶解的,如果找到合适的酶,这样就可以确定翻译修饰的具体位点。...

对,我现在就是想把蛋白纯化出来,经过酶解等操作把多肽进液质,分析该蛋白有哪些翻译后修饰。后面的操作我都会,现在的问题就是纯化做IP,觉得难做

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7楼2016-06-22 21:03:26
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