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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 生物化学 » WB膜考染都能看出条带，结果一抗二抗反映后不显色！
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ycfall88

新虫 (初入文坛)

[求助] WB膜考染都能看出条带，结果一抗二抗反映后不显色！ 已有1人参与

我们实验室的蛋白是碱性蛋白，等电点9.2左右，一直在做WB的试验，半干转结果都不行。现在摸索了一个条件，转膜电流大约是1.5mA/cm2，45min，用的不连续缓冲体系，TRIS/GLY，pH约9.6。阴极加0.1%的SDS，阳极加了甲醇15%，PVDF膜也用甲醇活化。因为二抗快没了，所以就直接拿转移完的膜考染，发现100ng位置都有显色，好欣慰。。。而且PVDF膜的考染结果比NC膜好很多，所以决定用PVDF膜接着往下做。

    昨天用一抗1h，二抗40min，都是1：1000稀释的，DAB试剂盒显色的，只有200ng位置非常淡。。。我们的一抗二抗应该是没问题的，因为之前用直接点膜的方法也做过，100ng的量显色非常深。不过点膜方法用的是NC膜。

    求助各位，问题可能出在哪里呢。。。洗脱液TBST，用的吐温80，会有问题吗。。。。
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1楼 2016-06-21 10:45:30
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Sharon_Xiang

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我们配一般都是用吐温20的 80会不会洗脱太厉害了
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2楼2016-06-21 14:37:51
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star013

新虫 (知名作家)
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3楼2016-06-21 17:19:06
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ycfall88

新虫 (初入文坛)
自己顶一下，希望谁能拯救拯救我！！
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4楼2016-06-22 15:28:46
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