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刘氏响声丸

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[求助] 关于在pET28b载体蛋白表达的问题，求助

各位虫友

最近做蛋白在pET-28b表达，c端融合蛋白

现在我的目的基因在pGEM－T载体上，想直接酶切NcoI和sacI得到目的基因，然后跟pet28连接

现在的问题是，蛋白表达是在NcoI处开始吗，但是后面我的基因启动子在离NcoI大概100bp

这个时候，蛋白表达会受影响吗，还是说不能表达

谢谢各位了

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1楼 2016-06-20 19:00:04

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atlanticwi

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【答案】应助回帖

★
xn8008: 金币+1, 应助指数+1, 欢迎积极回帖 2016-06-21 08:40:52

1) 28b 是N，C端均融合6xHis吧，所以你做C端融合用这个是否不合适？
2) 正因为也有N端融合的，所以是从NcoI的ATG开始算起的。
3) 我估计你是想直接切掉NcoI然后用你自己的基因代替NcoI的ATG，以达到C-端融合目的。但pET系列有单纯的C-端融合吧(我记得)，干吗这么费劲？
4) 你原理搞不清，原核表达系统直接利用CDS往上连接，与融合标签通读就可以，哪里需要启动子区域？（还是说你没表述清楚，你是否想说起始密码子？）

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Let God do with it as He wills

2楼2016-06-20 19:51:58

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xn8008: 金币+1, 欢迎积极交流 2016-06-21 08:41:10

引用回帖:

2楼: Originally posted by atlanticwi at 2016-06-20 19:51:58
1) 28b 是N，C端均融合6xHis吧，所以你做C端融合用这个是否不合适？
2) 正因为也有N端融合的，所以是从NcoI的ATG开始算起的。
3) 我估计你是想直接切掉NcoI然后用你自己的基因代替NcoI的ATG，以达到C-端融合目的。 ...

1.酶切NcoI位点把N端his切掉了的。
2.我之前设计了对应载体NcoI和NotI的引物，BspHI和NotI，PCR出来了老师不让我直接连pET。。。。。
3.现在目的基因在pGEM载体上，用NcoI切可以得到目的片段，但是在目的基因歧视密码子前面有一段基因，并不是取代NcoI的ATG，我现在只有pET28b。
4.所以我想问一下NcoI的ATG和我的目的基因的ATG表达会有什么影响

最后一个是我最关心的，我不太理解到底蛋白表达开始在哪个ATG
表达不清楚，请见谅

谢谢帮助

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3楼2016-06-21 08:29:59

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