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zy晨曦

新虫 (小有名气)

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[交流] 蛋白纯化手记

经过多次蛋白纯化实验，还是在细节中出现很多的错误，比如缓冲液在调整ph后定容，发现ph改变了。再比如酶液在调整ph时加酸过快导致部分蛋白变性析出等等，细节决定一切的道理在今天的实验中体现地真真切切的。由于一直在优化ph对酶活回收率的提高问题，所以今天选择了6.5和6.0两个ph上样，洗脱。6.5ph的酶液是利用7.5酶液加0.05m的磷酸二氢钠调节的。6.0ph是利用酶液加磷酸溶液和磷酸二氢钠，因为磷酸对蛋白影响大，所以加了一点之后就改用后者了。6.0酶液的离子强度应该比较大，这对实验是有很大影响的，下次将首先调节ph后在超滤，尽量维持较低的离子强度。洗脱过程中由于缓冲液的ph出现问题，也就是调整ph后定容ph变高了。所以两个实验的洗脱流出液ph基本上都是6.7左右，介于6.5和6.0中间。洗脱过程中只有0.4N出现酶活，以前都是在0.2开始出现。对比以前的实验发现，是上样量的问题，上样多，0.2N就洗脱出酶活。上样少0.4才能洗脱出。洗脱后计算6.5洗脱酶活77%，6.0洗脱酶活90%。虽然实验千疮百孔，但是结果如此还是想以此作为参考，进行下一次的重复实验。毕竟这次的实验酶活回收率是有差别的。

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