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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求助 如何设计带酶切位点的引物
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可以吗

银虫 (小有名气)

[交流] 求助 如何设计带酶切位点的引物

我已扩增了目的基因并测序了，其中包括起始密码子和终止密码子，现在想做原核表达，先要设计带酶切位点的引物，哪位做过的虫有能帮，设计时都要注意什么？具体怎么弄？先谢谢了。
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1楼 2008-11-04 17:14:27
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guoxingjun2008

金虫 (正式写手)
这么一说，我也好像有点明白了
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5楼2008-11-05 17:36:15
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
DNA合成，新链的延伸方向是5→3
因此，需要在5端加上酶切位点
酶切位点可以上网查
同时，记得再加上一些保护碱基
因为内切酶除了有特异的识别位点之外，还需多几个无需特异性的碱基提供一个platform让它可以结合上去，否则会掉下来
保护碱基的具体数目可以上NEB的网站查
那么，引物的结构就是（5→3）：保护碱基+酶切位点+原来的引物序列
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2楼2008-11-04 18:19:35
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可以吗

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 三磷酸腺苷 at 2008-11-4 18:19:
DNA合成，新链的延伸方向是5→3
因此，需要在5端加上酶切位点
酶切位点可以上网查
同时，记得再加上一些保护碱基
因为内切酶除了有特异的识别位点之外，还需多几个无需特异性的碱基提供一个platform让它可以结 ...

那 易产生星号活性及可能产生甲基化的酶 是怎么回事？设计的引物在后期转译时出现错位 又是怎么回事呢？
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3楼2008-11-04 21:30:37
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wjswj

木虫 (正式写手)

小木虫领金币专业户
注意一下质粒载体在插入了你的外援片段后编码框的变化，就是要保证你的序列出来的氨基酸序列是正确的。这就要考虑好你加入的碱基个数及切点，要确保你自己加入的起始密码起作用而不是载体上的起始密码起作用。
      甲基化酶及星活性基本不用考虑，你的载体会提供给你具体序列。你需要注意多克隆位点可以给你提供哪些可以选择的酶，而这些酶又不能出现在你的片段及载体上，剩下的就是你可以使用的酶了。看好酶切点在多克隆位点上的位置，注意好插入序列的方向，给引物加上正确的酶识别序列及保护碱基。
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金币是赌出来的
4楼2008-11-05 10:36:50
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