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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 干扰/敲除 » cas9靶位点基因退火
汕头大学海洋科学接受调剂
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qiusiqi

银虫 (初入文坛)

[交流] cas9靶位点基因退火 已有3人参与

最近在做cas9，靶位点20bp基因退火然后做大肠杆菌转化，一直转化不成功，求各位指点一下。用的一下程序。
退火：F位点序列2ul ， R位点序列 2ul ，tap buffer2ul ，dd水14ul。94℃10min冷却至室温。
质粒酶切：BsaI酶1ul，buffer5ul，质粒10ul，dd水34ul。37℃60min。然后65℃热失活20min。
5段磷酸化：退火产物5ul，T4PNK酶1ul，10xbuffer2ul，dd水12ul。37℃30min
T4连接酶链接:靶位点dna3ul，载体1ul，T4酶0.5ul，buffer2ul，dd水3.5ul。25℃90min。
用以上步骤总是连接不上，不知哪里出了问题。求各位指点。。。。
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1楼 2016-06-03 15:12:23
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草溪河

铁虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
可以把引物F和R同时进行pnk磷酸化（添加有ATP），再用沸水煮5分钟，待其在随沸水自然冷却复性，以后连接载体。

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3楼2016-06-03 23:25:43
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kangaroo0513

新虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=10321749&authorid=2621902
上次我就和你说去看我回复别人的帖子。。然后又看到你再问。。
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2楼2016-06-03 22:49:46
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qiusiqi

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by kangaroo0513 at 2016-06-03 22:49:46
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=10321749&authorid=2621902
上次我就和你说去看我回复别人的帖子。。然后又看到你再问。。

上次我已经看过了。我们做不了降落PCR..
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4楼2016-06-04 09:02:04
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qiusiqi

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 草溪河 at 2016-06-03 23:25:43
可以把引物F和R同时进行pnk磷酸化（添加有ATP），再用沸水煮5分钟，待其在随沸水自然冷却复性，以后连接载体。

谢谢
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5楼2016-06-04 09:02:37
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