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请问感受态怎么制备 已有2人参与
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做转化中，感受态已经用的差不多了，想自己制备一些，省的买了，求一成功率较高的方法，或者是CaCl2 法的具体步骤，多谢！ 发自小木虫Android客户端 |
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安静de执着14
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【答案】应助回帖
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E.coli感受态细胞的制备（CaCl2法） 一、准备 1．高压灭菌50毫升，15毫升离心管；180℃高温灭菌100毫升血清瓶7个，25毫升血清瓶1个，100毫升、20毫升量筒或容量瓶各1个，150毫升、50毫升烧杯各1个，摇菌用150毫升锥形瓶1个。甘油灭菌。10ml移液管3支。 2．制备灭菌水约1000毫升。 3．制备不含氨苄的LB液体培养基500ml；制备不含氨苄的LB培养基平板1-3块。 4．配置1M NaOH 以调节pH用。 5．制备针式过滤器2个，60ml、20ml 一次性注射器各一个。 6．冷冻离心机换50ml转子。 7．按下表配置TFB1、TFB2溶液。 严格按照表中顺序加溶液，配制工作液，再调pH值，过滤除菌，4℃储存。 TFB1（终体积：100ml） MES（0.5M）: 2ml KCl（1M）: 10ml CaCl2?2H2O（1M）: 1ml MnCl2?4H2O（0.5M）: 10ml TFB2 （终体积：20ml） MOPS（1M）： 0.2ml CaCl2?2H2O（1M）: 1.5 ml KCl（1M）: 10ml 甘油（50%）： 6ml 成分 分子式 分子量 储存浓度 储存液准备 MES C6H13NO4S 195.2 0.5M 9.76g/100ml 氯化钾 KCl 74.55 1M 7.455g/100ml 氯化钙（二水） CaCl2?2H2O 147.02 1M 14.702g/100ml 氯化锰（四水） MnCl2?4H2O 197.91 0.5M 9.8955g/100ml MOPS C7H15NO4S 209.27 1M 20.927g/100ml 甘油 50% 50ml/100ml 注：1、MES为：2-N-Morpholino-ethanesulfonic Acid,即2-（N-吗啡啉）乙磺酸。不易溶，配制时用NaOH调pH至6.2。 2、MOPS为：3-N-Morpholino propanesulfonic Acid,即3-（N-吗啡代）丙磺酸。 3、严格按顺序加溶液，配制TFB1工作液，用1M NaOH 调pH值至5.8，用针式过滤器过滤除菌，4℃储存。 4、严格按顺序加溶液，配制TFB2工作液，用1M NaOH调pH值至6.5，用针式过滤器过滤除菌，4℃储存。 （如果上述pH值在一开始时就偏碱，可以用冰乙酸回调） 二、操作步骤： 全过程冰上4℃操作，4℃离心，无菌操作。 划板。挑取宿主菌，在AMP-的LB琼脂糖培养基平板上划线，37℃培养16h。 1、 从过夜培养的不含氨苄的LB平板上挑单个大菌落，接种到5毫升LB液体培养基中，37℃，200rpm，振荡培养过夜。 2、 按1：100将500ul培养物接种到50毫升不含氨苄、预热的LB液体培养基中，37℃，200rpm，振荡培养至OD600=0.45～0.5（约需2～2.5小时）。 3、 0℃（冰上）预冷15分钟。 4、 4000rpm，5分钟，4℃离心收集菌体。弃上清，用15ml TFB1悬浮菌体（涡旋振荡）。冰上放置15分钟。准备1.5毫升离心管30个，冰上预冷。 5、 4000rpm，5分钟，4℃离心收集菌体。弃上清，用3ml TFB2悬浮菌体（涡旋振荡）。冰上放置15分钟。 6、 按100ul/管，将细菌在冰上分装到预冷的离心管（1.5ml）中，转入-80℃冰箱储存。 注：用质粒验证感受态细胞。 发自小木虫Android客户端 |
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qhiv64楼2016-05-23 23:58:16
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5楼2016-05-24 00:01:04
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