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最近一直在纯化HIS标签蛋白，用的是sf9细胞表达，老是出问题.。。。 已有1人参与
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实验室用的sf9细胞裂解液配方：20mM的Tris-cl(PH7.8), 0.5mM EGTA 1mM EDTA 1M Mgcl2 10%甘油 200mM 氯化钠 0.5% NP40 HIS-wash :50mM磷酸盐缓冲液（ph8.0） 500mM氯化钠 10%甘油 1%Triton-100 20mM咪唑 HIS-Elution:250mM咪唑，其他和WASH一样 对于sf9细胞裂解液里边为何同时加EDTA和镁离子，有点搞不懂。还有就是氯化钠的浓度是不是小？ 对于以上三种溶液可不可以加一些DTT或者β-巯基乙醇，浓度是多少呢？ 100ml的培养基离心后获得细胞加入了5ml裂解液（相应l体积的PMSF），超声裂解，冰上30min，离心得上清，用 2倍体积上清的wash buffer和上清混匀后，4度和beads孵育过夜（原300ml培养基得到的细胞，用1了ml的beads,少吗？） 20mM咪唑，250mM分别洗柱子，最后抗体，考然检测有些目的蛋白甚少（要纯化5亚基复合物，只有一个亚基带了HIS标签），是蛋白本身表达量少还是所用BUFFER不合适呢？ 还有就是如何确定这个多亚基蛋白的PI呢？ 折腾了一两个月了，被老板熊，，，，，哎 着急呀  。还请各位虫友支支招呀！！！！！！！！！@gyesang@hc-material |
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2楼2016-05-18 09:04:28
hc-material
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
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1.你没发电泳图，我们也不能判断是表达上的问题，还是纯化上的问题。 2.裂解液建议你用平衡BUF.加EDTA会影响镍柱的。 3.加DTT可以，万分之一就可以了。 4.1mlbeads的吸附量大概40mg蛋白。根据你的目标蛋白含量自己计算。 5.测蛋白的PI可以用双向电泳法。 祝顺利。 |
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3楼2016-05-18 13:38:19
4楼2016-05-18 19:50:58
5楼2016-05-18 20:04:16
送红花一朵 |
1.不好意思，MARKER其中一个条带给标错了，里边第二条红色的MARKER是50K。 2.参照一些网友宝贵的建议，稍作修改，您看这些配方可以吗？ SF-9细胞裂解液：50mM phasphate buffer ,pH8.0 300mM 氯化钠 10mM 咪唑（10-20mM之间可调） 20mM β-ME 10% 甘油 1% Triton X-100 0.5% NP-40 WASH buffer: 50mM phasphate buffer ,pH8.0 500mM 氯化钠 10% 甘油 1% Triton X-100 20mM 咪唑 Elution buffer: 50mM phasphate buffer ,pH8.0 500mM 氯化钠 10% 甘油 1% Triton X-100 250mM 咪唑(100-250mM之间可调) 3.我们实验室的做法是，先裂解sf9昆虫细胞（里边加相应的PMSF），收上清，将上清和两倍其体积的Wash buffer混匀，接着加入经10%BSA（终浓度1%）孵育过的Ni-NTA beads，4度摩天轮过夜，第二条将beads装柱，接着wash 和Elute，收集馏分。 您看这个beads需要BSA提前封闭孵育吗? 假如换用以上新的buffer配方，裂解液可以直接与beads混合吗？我担心裂解液粘度大会影响Pr与beads的结合 您提到了平衡buffer是？ |
6楼2016-05-18 20:19:19
