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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » 最近一直在纯化HIS标签蛋白，用的是sf9细胞表达，老是出问题.。。。
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ivirus

金虫 (正式写手)

[求助] 最近一直在纯化HIS标签蛋白，用的是sf9细胞表达，老是出问题.。。。 已有1人参与

实验室用的sf9细胞裂解液配方：20mM的Tris-cl(PH7.8),
                                                 0.5mM EGTA
                                                  1mM EDTA
                                                  1M Mgcl2
                                                  10%甘油
                                                   200mM  氯化钠
                                                    0.5% NP40
HIS-wash :50mM磷酸盐缓冲液（ph8.0）
                 500mM氯化钠
                10%甘油
                 1%Triton-100
                 20mM咪唑
HIS-Elution:250mM咪唑，其他和WASH一样


对于sf9细胞裂解液里边为何同时加EDTA和镁离子，有点搞不懂。还有就是氯化钠的浓度是不是小？
对于以上三种溶液可不可以加一些DTT或者β-巯基乙醇，浓度是多少呢？
100ml的培养基离心后获得细胞加入了5ml裂解液（相应l体积的PMSF），超声裂解，冰上30min，离心得上清，用 2倍体积上清的wash buffer和上清混匀后，4度和beads孵育过夜（原300ml培养基得到的细胞，用1了ml的beads,少吗？）
20mM咪唑，250mM分别洗柱子，最后抗体，考然检测有些目的蛋白甚少（要纯化5亚基复合物，只有一个亚基带了HIS标签），是蛋白本身表达量少还是所用BUFFER不合适呢？
还有就是如何确定这个多亚基蛋白的PI呢？

折腾了一两个月了，被老板熊，，，，，哎  着急呀。还请各位虫友支支招呀！！！！！！！！！@gyesang@hc-material
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奔三的年纪 想换个环境
1楼 2016-05-18 01:38:16
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030Selma

金虫 (正式写手)
柱子说明书中EDTA的浓度不能超过多少？我觉得EDTA会影响his tag的结合

发自小木虫IOS客户端
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ivirus
2楼2016-05-18 09:04:28
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hc-material

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ...
感谢参与，应助指数 +1
ivirus: 金币+10, ★★★很有帮助 2016-05-18 20:20:55
ivirus: 金币+56 2016-05-19 21:26:48
1.你没发电泳图，我们也不能判断是表达上的问题，还是纯化上的问题。
2.裂解液建议你用平衡BUF.加EDTA会影响镍柱的。
3.加DTT可以，万分之一就可以了。
4.1mlbeads的吸附量大概40mg蛋白。根据你的目标蛋白含量自己计算。
5.测蛋白的PI可以用双向电泳法。

祝顺利。
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ivirus
3楼2016-05-18 13:38:19
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ivirus

金虫 (正式写手)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by 030Selma at 2016-05-18 09:04:28
柱子说明书中EDTA的浓度不能超过多少？我觉得EDTA会影响his tag的结合

EDTA, EGTA •Strip nickel ions from resin •Up to 1 mM has been used
                                                         successfully in some cases, but
                                                            care must be taken

这是PROTOCAL上写的，可以用1mM，只是在某些情况下。BUT，不建议使用。那我可不可以直接放弃，在sf9裂解液中不用这些螯合剂呢？
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奔三的年纪 想换个环境
4楼2016-05-18 19:50:58
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金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by hc-material at 2016-05-18 13:38:19
1.你没发电泳图，我们也不能判断是表达上的问题，还是纯化上的问题。
2.裂解液建议你用平衡BUF.加EDTA会影响镍柱的。
3.加DTT可以，万分之一就可以了。
4.1mlbeads的吸附量大概40mg蛋白。根据你的目标蛋白含量自 ...

我要的蛋白大亚基140左右，另外四个都是34-40之间的，相差很小。
感觉就看不到有啥疑似条带。。。。。
最近一直在纯化HIS标签蛋白，用的是sf9细胞表达，老是出问题.。。。
这是用之前提到的配方过得NI柱,12%胶（E1-7用250mM,E8-10用500mM咪唑。W5顺序当时给搞反了）.jpg
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奔三的年纪 想换个环境
5楼2016-05-18 20:04:16
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金虫 (正式写手)
送红花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by hc-material at 2016-05-18 13:38:19
1.你没发电泳图，我们也不能判断是表达上的问题，还是纯化上的问题。
2.裂解液建议你用平衡BUF.加EDTA会影响镍柱的。
3.加DTT可以，万分之一就可以了。
4.1mlbeads的吸附量大概40mg蛋白。根据你的目标蛋白含量自 ...

1.不好意思，MARKER其中一个条带给标错了，里边第二条红色的MARKER是50K。
2.参照一些网友宝贵的建议，稍作修改，您看这些配方可以吗？
  SF-9细胞裂解液：50mM phasphate buffer ,pH8.0

                            300mM 氯化钠

                           10mM 咪唑（10-20mM之间可调）

                           20mM β-ME

                            10% 甘油

                           1% Triton X-100

                            0.5% NP-40


WASH buffer:  50mM phasphate buffer ,pH8.0

                           500mM 氯化钠

                          10% 甘油

                           1% Triton X-100

                          20mM 咪唑


Elution buffer:   50mM phasphate buffer ,pH8.0

                           500mM 氯化钠

                          10% 甘油

                           1% Triton X-100

                          250mM 咪唑(100-250mM之间可调)

3.我们实验室的做法是，先裂解sf9昆虫细胞（里边加相应的PMSF），收上清，将上清和两倍其体积的Wash buffer混匀，接着加入经10%BSA（终浓度1%）孵育过的Ni-NTA beads，4度摩天轮过夜，第二条将beads装柱，接着wash 和Elute，收集馏分。


您看这个beads需要BSA提前封闭孵育吗?

假如换用以上新的buffer配方，裂解液可以直接与beads混合吗？我担心裂解液粘度大会影响Pr与beads的结合

您提到了平衡buffer是？
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奔三的年纪 想换个环境
6楼2016-05-18 20:19:19
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