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[求助]
求助！我的空白对照组老是有条带！
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大家好，先说说我实验的情况。我的对照组是真核表达载体pJW4303，实验组是pJW4303-NSs-FLAG，目的质粒是选取的某个病毒的基因片段，可以分泌目的蛋白NSs。目的蛋白大小34KD。把上述质粒转染到293T细胞后收集上清和裂解，-20度保存。 WB的目的是验证NSs这个蛋白在细胞中是否表达。因为这个蛋白没有商品化的抗体，所以我们之前的一抗都是用的小鼠免疫的血清（相当于多克隆抗体），做出来的条带有很多杂带，而且空载体的裂解里在目的蛋白位置也有条带，重新转染空载体质粒也还是这个结果，当时认为是非特异性条带。我们的解决方法是在目的质粒上加了个FLAG（之前的目的质粒都是pJW4303-NSs），重新转染293T细胞，收集上清和裂解，用的一抗是鼠源的anti-FLAG单克隆抗体（1：5000），二抗是羊抗鼠的IgG（H+L）（1：10000），曝光后空载体组还是有条带。。。于是我怀疑转染的时候污染了，又用以前转染的4303跑（浓度稍微低点）还是可以看到目的蛋白位置有比较淡的条带，真的不知道是怎么回事啊啊？有没有大神帮帮我啊，我做了差不多大半年了就是跑不出。 附图：  一抗用的血清，1：300  内参β-actin，大小43kD，1：1000  一抗鼠源anti-FLAg，1：5000 |
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2楼2016-05-17 23:38:22
