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遇到猫主人

新虫 (初入文坛)

[求助] 求助!我的空白对照组老是有条带!

大家好,先说说我实验的情况。我的对照组是真核表达载体pJW4303,实验组是pJW4303-NSs-FLAG,目的质粒是选取的某个病毒的基因片段,可以分泌目的蛋白NSs。目的蛋白大小34KD。把上述质粒转染到293T细胞后收集上清和裂解,-20度保存。

WB的目的是验证NSs这个蛋白在细胞中是否表达。因为这个蛋白没有商品化的抗体,所以我们之前的一抗都是用的小鼠免疫的血清(相当于多克隆抗体),做出来的条带有很多杂带,而且空载体的裂解里在目的蛋白位置也有条带,重新转染空载体质粒也还是这个结果,当时认为是非特异性条带。我们的解决方法是在目的质粒上加了个FLAG(之前的目的质粒都是pJW4303-NSs),重新转染293T细胞,收集上清和裂解,用的一抗是鼠源的anti-FLAG单克隆抗体(1:5000),二抗是羊抗鼠的IgG(H+L)(1:10000),曝光后空载体组还是有条带。。。于是我怀疑转染的时候污染了,又用以前转染的4303跑(浓度稍微低点)还是可以看到目的蛋白位置有比较淡的条带,真的不知道是怎么回事啊啊?有没有大神帮帮我啊,我做了差不多大半年了就是跑不出。

附图:

求助!我的空白对照组老是有条带!
一抗用的血清,1:300


求助!我的空白对照组老是有条带!-1
内参β-actin,大小43kD,1:1000


求助!我的空白对照组老是有条带!-2
一抗鼠源anti-FLAg,1:5000
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030Selma

金虫 (正式写手)

2楼2016-05-17 23:38:22
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韩恋希

铜虫 (初入文坛)

可以问一下你的293t大小大概是多少么

发自小木虫Android客户端
3楼2016-07-26 10:00:46
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