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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 荧光定量PCR，溶解曲线出现双峰
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红太郎张玉

银虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by cencheng at 2016-05-18 22:15:32
可能模板不好，或者你是不是换染料了？

没有换染料，模板不好是指什么，浓度太低，质量不好？但是同样的模板检测其它种群的基因是没有问题的
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11楼2016-05-20 10:59:31
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cencheng

新虫 (小有名气)
★
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰·手有余香，谢谢你的理解与支持。祝您科研顺利，文章多多。 2016-06-12 17:47:11
我用不同的染料跑同一个模板，有些有双峰，有些是单峰，你可以跑一下定量温度梯度pcr，可能不同的退火温度对它也有影响！

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12楼2016-05-20 18:12:00
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sunxiaoxue

新虫 (初入文坛)
楼主请问你这个问题最后怎么解决的呀？我也遇到了同样的问题
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13楼2016-06-12 10:52:20
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030Selma

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引物非特异结合，需要重新设计引物。或者target gene丰度太低。或者模板有问题

发自小木虫IOS客户端
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14楼2016-06-12 10:57:16
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sunxiaoxue

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by 红太郎张玉 at 2016-05-18 20:04:05
能说具体点吗

你好我也遇到了同样的问题  我想问一下 模板浓度是太高了吗?还是太低的原因啊   标准品的曲线峰非常单一尖锐  但是同样的体系模板有时好有时不好
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15楼2016-06-13 14:36:51
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王平阳

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

你这种情况就是一对引物扩出了两种产物，这两种产物可能是目的序列出现多态性，如果是DNA样品，在杂交品种中极有可能出现，如果是cDNA样品，也有可能出现，这两种情况我都遇到过，所谓HRM对DNA分型就是用的这个原理；这两种产物也可能是其一是非特异性扩增，大小差异不大，一般的PCR分不开，但是GC含量不一样，溶解曲线很容易就分开了。
无论是哪种情况，将PCR产物测序就知道了，多测几个样，我就干过。

等等，你可能会说你的质粒只有一个峰，那必须的，你质粒上只是克隆了其中一种产物，是单克隆，自然只有一个峰，你没发现你质粒的峰和双峰的第二个峰是一致的吗，那么第一个峰就是多出来的另一种产物。

再等等，你的引物确实有问题，你没发现72℃左右还有一个峰吗？虽然质粒做模板特异性高，还是有峰的存在，所以你的质粒样品也不是单峰，而且环境样品该峰就凸显出来了，建议减少引物量或者重新设计引物。
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没有做不到，只有想不到！
16楼2016-06-13 17:57:51
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liufan1993

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
15楼: Originally posted by sunxiaoxue at 2016-06-13 14:36:51
你好我也遇到了同样的问题  我想问一下 模板浓度是太高了吗?还是太低的原因啊   标准品的曲线峰非常单一尖锐  但是同样的体系模板有时好有时不好...

请问这个问题你解决了吗？我最近也遇到相同的问题，标品可以，但是样品有的好有的不好
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17楼2016-12-28 22:33:21
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