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ganlanzhih

新虫 (初入文坛)

[求助] Native-page-胶图有疑问,请教大家帮忙解决一下 已有2人参与

最近在native-page,跑出来的条带如下图,很模糊,我用的配方如下,想问请教大家问题出在哪里,做了2次都是这样,谢谢各位啦~~~~~~~
工作液配制
1.40%胶贮液(Acr:Bis=29:1);
2.4×分离胶Buf(1.5 M Tris-HCl,pH 8.8):18.2 g Trisbase 溶于ml 水,用浓HCl调pH 8.8,加水定容到100ml,4℃贮存;
3. 4×堆积胶Buf(0.5 M Tris-HCl,pH 6.8):6g Trisbase 溶于80ml 水,用浓HCl调pH 6.8,加水定容到100ml,4℃贮存;
4.10×电泳Buf(pH8.8 Tris-Gly):30.3 g Trisbase, 144g 甘氨酸,加水定容到L,4℃贮存;
5.2×溴酚蓝上样Buf:1.25ml pH6.8, 0.5M Tris-Cl,3.0ml甘油,.2ml 0.5% 溴酚蓝,5.5ml dH2O; -20℃贮存;
6. 10%APS;
电泳胶的配制及电泳条件(上槽电极为负,下槽电极为正)
1. 碱性非变性胶 17%分离胶(10 ml) 4%堆积胶(5 ml)
2. 40%胶贮液(40%T,3.3%C) 4.25ml 0.5ml
3. 4×分离胶Buf(1.5 M Tris-HCl,pH 8.8)2.5ml
4. 4×堆积胶Buf(0.5 M Tris-HCl,pH 6.8) 1.25ml
5. 水 3.2ml
6. 10%APS 35ul
7. TEMED 15 ul
8. 10×电泳Buf(pH8.8 Tris-Gly):100ml稀释到L
电泳条件:100V恒压约20min,指示剂进入浓缩胶;改换160V恒压,当指示剂移动到胶板底部时,停止电泳,整个过程约90min。

Native-page-胶图有疑问,请教大家帮忙解决一下
图片1.png


Native-page-胶图有疑问,请教大家帮忙解决一下-1
图片2.png
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2015yu

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
8楼: Originally posted by fuyuandj86 at 2016-05-12 02:57:43
如果不是做EMSA,这样的native page一般来说都不好做,因为蛋白带负电荷很少
最好用blue native

如何加的考马斯亮蓝,直接称取加入酶液中?

发自小木虫Android客户端
15楼2017-03-05 23:07:09
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小兔血战到底

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你利用什么稀释的你的native page的?从40%的储存夜到17%的工作液,稀释的时候不需要加电泳buffer吗?
Gototheendoftheworldforyou
2楼2016-05-10 16:29:28
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ganlanzhih

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 小兔血战到底 at 2016-05-10 16:29:28
你利用什么稀释的你的native page的?从40%的储存夜到17%的工作液,稀释的时候不需要加电泳buffer吗?

前面的是配的溶液,后面的是17%配方,按照一定的比例,如下的比例分别上:
2. 40%胶贮液(40%T,3.3%C) 4.25ml
3. 4×分离胶Buf(1.5 M Tris-HCl,pH 8.8)2.5ml
5. 水 3.2ml
6. 10%APS 35ul
7. TEMED 15 ul

您也在做非变性胶吗   想请问一下 您知道这个结果是什么原因吗  谢谢
3楼2016-05-10 20:50:13
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ganlanzhih

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 小兔血战到底 at 2016-05-10 16:29:28
你利用什么稀释的你的native page的?从40%的储存夜到17%的工作液,稀释的时候不需要加电泳buffer吗?

您有配方吗 或者详细的实验操作步骤  可否共享一下 谢谢
4楼2016-05-10 20:56:08
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