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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » Native-page-胶图有疑问，请教大家帮忙解决一下
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ganlanzhih

新虫 (初入文坛)

[求助] Native-page-胶图有疑问，请教大家帮忙解决一下 已有2人参与

最近在native-page，跑出来的条带如下图，很模糊，我用的配方如下，想问请教大家问题出在哪里，做了2次都是这样，谢谢各位啦~~~~~~~
工作液配制
1.40%胶贮液(Acr:Bis=29：1）；
2.4×分离胶Buf(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8)：18.2 g Trisbase 溶于ml 水，用浓HCl调pH 8.8，加水定容到100ml，4℃贮存；
3. 4×堆积胶Buf(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8)：6g Trisbase 溶于80ml 水，用浓HCl调pH 6.8，加水定容到100ml，4℃贮存；
4.10×电泳Buf（pH8.8 Tris-Gly）:30.3 g Trisbase， 144g 甘氨酸，加水定容到L，4℃贮存；
5.2×溴酚蓝上样Buf:1.25ml pH6.8, 0.5M Tris-Cl，3.0ml甘油，.2ml 0.5% 溴酚蓝，5.5ml dH2O； -20℃贮存；
6. 10％APS；
电泳胶的配制及电泳条件（上槽电极为负，下槽电极为正）
1. 碱性非变性胶 17%分离胶(10 ml) 4%堆积胶(5 ml)
2. 40%胶贮液(40%T,3.3%C） 4.25ml 0.5ml
3. 4×分离胶Buf(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8)2.5ml
4. 4×堆积胶Buf(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8) 1.25ml
5. 水 3.2ml
6. 10％APS 35ul
7. TEMED 15 ul
8. 10×电泳Buf（pH8.8 Tris-Gly）:100ml稀释到L
电泳条件:100V恒压约20min，指示剂进入浓缩胶；改换160V恒压，当指示剂移动到胶板底部时，停止电泳，整个过程约90min。

Native-page-胶图有疑问，请教大家帮忙解决一下
图片1.png


Native-page-胶图有疑问，请教大家帮忙解决一下-1
图片2.png
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1楼 2016-05-10 11:22:41
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ganlanzhih

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 小兔血战到底 at 2016-05-10 16:29:28
你利用什么稀释的你的native page的？从40%的储存夜到17％的工作液，稀释的时候不需要加电泳buffer吗？

您有配方吗 或者详细的实验操作步骤  可否共享一下 谢谢
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4楼2016-05-10 20:56:08
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fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲，勿施于人

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
如果不是做EMSA，这样的native page一般来说都不好做，因为蛋白带负电荷很少
最好用blue native
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The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
8楼2016-05-12 02:57:43
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小兔血战到底

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你利用什么稀释的你的native page的？从40%的储存夜到17％的工作液，稀释的时候不需要加电泳buffer吗？
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Gototheendoftheworldforyou
2楼2016-05-10 16:29:28
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ganlanzhih

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 小兔血战到底 at 2016-05-10 16:29:28
你利用什么稀释的你的native page的？从40%的储存夜到17％的工作液，稀释的时候不需要加电泳buffer吗？

前面的是配的溶液，后面的是17%配方，按照一定的比例，如下的比例分别上：
2. 40%胶贮液(40%T,3.3%C） 4.25ml
3. 4×分离胶Buf(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8)2.5ml
5. 水 3.2ml
6. 10％APS 35ul
7. TEMED 15 ul

您也在做非变性胶吗   想请问一下 您知道这个结果是什么原因吗  谢谢
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3楼2016-05-10 20:50:13
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小兔血战到底

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by ganlanzhih at 2016-05-10 20:50:13
前面的是配的溶液，后面的是17%配方，按照一定的比例，如下的比例分别上：
2. 40%胶贮液(40%T,3.3%C） 4.25ml
3. 4×分离胶Buf(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8)2.5ml
5. 水 3.2ml
6. 10％APS 35ul
7. TEMED 15 ul
...

是这样的，我一直也在做native page，虽然我的胶并不需要浓缩胶，但是道理是一样的。我利用的是TBE作为running buffer，所以在用30％的储存液配制6%的工作也的时候，需要加入一定量的TBE来稀释。 给你配方你研究一下。
6% native page

30% native page            8 mL
10＊ TBE                       4 mL
10% APS                    300 ul
TEMED                        60 ul
MQ water                 up to 40 mL
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Gototheendoftheworldforyou
5楼2016-05-11 11:10:22
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ganlanzhih

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 小兔血战到底 at 2016-05-11 11:10:22
是这样的，我一直也在做native page，虽然我的胶并不需要浓缩胶，但是道理是一样的。我利用的是TBE作为running buffer，所以在用30％的储存液配制6%的工作也的时候，需要加入一定量的TBE来稀释。 给你配方你研究一 ...

非常感谢您的回复！想问一下，你所用的30%native page 的配方是怎样的呢？样品也是普通的蛋白样品吗？我做的是植物蛋白，还想请假一下您的running buffer是1*TBE？还有你跑胶的电压和时间？也是用考马斯亮蓝染色吗？谢谢
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6楼2016-05-11 13:30:48
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ganlanzhih

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 小兔血战到底 at 2016-05-11 11:10:22
是这样的，我一直也在做native page，虽然我的胶并不需要浓缩胶，但是道理是一样的。我利用的是TBE作为running buffer，所以在用30％的储存液配制6%的工作也的时候，需要加入一定量的TBE来稀释。 给你配方你研究一 ...

您做的是细胞蛋白？是EMSA？要用到探针？
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7楼2016-05-11 13:48:25
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ganlanzhih

新虫 (初入文坛)
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8楼: Originally posted by fuyuandj86 at 2016-05-12 02:57:43
如果不是做EMSA，这样的native page一般来说都不好做，因为蛋白带负电荷很少
最好用blue native

您好  非常感谢您的回复   我做的是植物蛋白的分离纯化  因为不知道分子量  所以想用这种方式来初步确定一下蛋白的分子量  您说的blue native 有具体的实验方案吗？ 可否分享一下或者给一些其他方面的建议？谢谢
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9楼2016-05-12 09:52:01
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小兔血战到底

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by ganlanzhih at 2016-05-11 13:48:25
您做的是细胞蛋白？是EMSA？要用到探针？...

我做的是DNA链接了streptavidin，将DNA利用同位素标记，然后跑native page。所以并不需要考马斯亮蓝染色。我用的是1*的TBE作为running buffer。电压一般控制在200V一下，时间的话要根据不同的蛋白质大小了，我一般是一个半小时左右
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10楼2016-05-12 11:30:32
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