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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » Native-page-胶图有疑问，请教大家帮忙解决一下
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ganlanzhih

新虫 (初入文坛)

[求助] Native-page-胶图有疑问，请教大家帮忙解决一下 已有2人参与

最近在native-page，跑出来的条带如下图，很模糊，我用的配方如下，想问请教大家问题出在哪里，做了2次都是这样，谢谢各位啦~~~~~~~
工作液配制
1.40%胶贮液(Acr:Bis=29：1）；
2.4×分离胶Buf(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8)：18.2 g Trisbase 溶于ml 水，用浓HCl调pH 8.8，加水定容到100ml，4℃贮存；
3. 4×堆积胶Buf(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8)：6g Trisbase 溶于80ml 水，用浓HCl调pH 6.8，加水定容到100ml，4℃贮存；
4.10×电泳Buf（pH8.8 Tris-Gly）:30.3 g Trisbase， 144g 甘氨酸，加水定容到L，4℃贮存；
5.2×溴酚蓝上样Buf:1.25ml pH6.8, 0.5M Tris-Cl，3.0ml甘油，.2ml 0.5% 溴酚蓝，5.5ml dH2O； -20℃贮存；
6. 10％APS；
电泳胶的配制及电泳条件（上槽电极为负，下槽电极为正）
1. 碱性非变性胶 17%分离胶(10 ml) 4%堆积胶(5 ml)
2. 40%胶贮液(40%T,3.3%C） 4.25ml 0.5ml
3. 4×分离胶Buf(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8)2.5ml
4. 4×堆积胶Buf(0.5 M Tris-HCl，pH 6.8) 1.25ml
5. 水 3.2ml
6. 10％APS 35ul
7. TEMED 15 ul
8. 10×电泳Buf（pH8.8 Tris-Gly）:100ml稀释到L
电泳条件:100V恒压约20min，指示剂进入浓缩胶；改换160V恒压，当指示剂移动到胶板底部时，停止电泳，整个过程约90min。

Native-page-胶图有疑问，请教大家帮忙解决一下
图片1.png


Native-page-胶图有疑问，请教大家帮忙解决一下-1
图片2.png
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1楼 2016-05-10 11:22:41
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fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲，勿施于人
引用回帖:
9楼: Originally posted by ganlanzhih at 2016-05-11 13:52:01
您好  非常感谢您的回复   我做的是植物蛋白的分离纯化  因为不知道分子量  所以想用这种方式来初步确定一下蛋白的分子量  您说的blue native 有具体的实验方案吗？ 可否分享一下或者给一些其他方面的建议？谢谢...

blue native实验步骤： http://www.nature.com/nprot/journal/v1/n1/full/nprot.2006.62.html
蛋白如果要进到胶里需要带负电荷的，native page的电荷取决于等电点，大部分蛋白带电荷很少，所以都进不去胶
所以需要用蓝色染料给蛋白带点负电荷
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The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
13楼2016-05-15 04:20:07
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小兔血战到底

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你利用什么稀释的你的native page的？从40%的储存夜到17％的工作液，稀释的时候不需要加电泳buffer吗？
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Gototheendoftheworldforyou
2楼2016-05-10 16:29:28
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ganlanzhih

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 小兔血战到底 at 2016-05-10 16:29:28
你利用什么稀释的你的native page的？从40%的储存夜到17％的工作液，稀释的时候不需要加电泳buffer吗？

前面的是配的溶液，后面的是17%配方，按照一定的比例，如下的比例分别上：
2. 40%胶贮液(40%T,3.3%C） 4.25ml
3. 4×分离胶Buf(1.5 M Tris-HCl，pH 8.8)2.5ml
5. 水 3.2ml
6. 10％APS 35ul
7. TEMED 15 ul

您也在做非变性胶吗   想请问一下 您知道这个结果是什么原因吗  谢谢
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3楼2016-05-10 20:50:13
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ganlanzhih

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 小兔血战到底 at 2016-05-10 16:29:28
你利用什么稀释的你的native page的？从40%的储存夜到17％的工作液，稀释的时候不需要加电泳buffer吗？

您有配方吗 或者详细的实验操作步骤  可否共享一下 谢谢
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2016-05-10 20:56:08
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