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南方科技大学公共卫生及应急管理学院2025级博士研究生招生报考通知
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lrxczy

铁虫 (初入文坛)

[求助] 瞬转真核细胞表达蛋白后分子量大了一倍,是什么原因?

我构建了两个重组质粒pEGFP-C1-F和pEGFP-C1-H,plojet瞬转hela细胞,在不同时间点用GFP抗体检测蛋白表达,发现表达后的F和H蛋白比在大肠杆菌和网上预测的蛋白分子质量大了一倍,我已经考虑GFP标签的大小了,还是打了一倍,比如F蛋白带上GFP标签应该是50KD左右,现在变成了90多KD,是什么原因呢?对于后续检测蛋白的功能有没有影响呢?非常感谢!!!
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小周

铁杆木虫 (著名写手)

真核表达的是二聚体吧,还原电泳看看。

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2楼2016-05-09 17:20:45
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lrxczy

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 小周 at 2016-05-09 17:20:45
真核表达的是二聚体吧,还原电泳看看。

非常感谢!我不太懂这个二聚体是怎么回事,如果是二聚体的原因,跑还原性电泳,再转膜做western就能是原来预测的大小吗?
3楼2016-05-09 17:47:36
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小周

铁杆木虫 (著名写手)

可以!你可以做一个还原的,一个非还原的对着看。

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4楼2016-05-09 19:38:39
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lrxczy

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 小周 at 2016-05-09 19:38:39
可以!你可以做一个还原的,一个非还原的对着看。

我现在做的就是变性的电泳,但是变性电泳应该是把蛋白的结构都打开了啊,如果有二聚体也应该是打开的呀,还原性电泳不变性,更应该是二聚体折叠的结构吧……

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5楼2016-05-09 20:05:46
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小周

铁杆木虫 (著名写手)

还原的意思是打开二硫键

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6楼2016-05-09 20:20:57
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lrxczy

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 小周 at 2016-05-09 20:20:57
还原的意思是打开二硫键

我现在做的SDSPAGE就是处理样品时加巯基乙醇的,不是打开二硫键了吗

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7楼2016-05-09 22:36:57
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小周

铁杆木虫 (著名写手)

你查查你的蛋白是不是糖蛋白,糖基化程度多高?原核里没有翻译后修饰。

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8楼2016-05-10 05:46:28
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lrxczy

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
8楼: Originally posted by 小周 at 2016-05-10 05:46:28
你查查你的蛋白是不是糖蛋白,糖基化程度多高?原核里没有翻译后修饰。

谢谢!我分析过后应该怎样验证呢?是不是糖蛋白,是不是二聚体,应该用什么样的实验方法验证?

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9楼2016-05-11 06:54:39
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