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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 细胞科学 » 瞬转真核细胞表达蛋白后分子量大了一倍，是什么原因？
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lrxczy

铁虫 (初入文坛)

[求助] 瞬转真核细胞表达蛋白后分子量大了一倍，是什么原因？

我构建了两个重组质粒pEGFP-C1-F和pEGFP-C1-H，plojet瞬转hela细胞，在不同时间点用GFP抗体检测蛋白表达，发现表达后的F和H蛋白比在大肠杆菌和网上预测的蛋白分子质量大了一倍，我已经考虑GFP标签的大小了，还是打了一倍，比如F蛋白带上GFP标签应该是50KD左右，现在变成了90多KD，是什么原因呢？对于后续检测蛋白的功能有没有影响呢？非常感谢！！！
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1楼 2016-05-09 17:00:43
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小周

铁杆木虫 (著名写手)
真核表达的是二聚体吧，还原电泳看看。

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2楼2016-05-09 17:20:45
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lrxczy

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 小周 at 2016-05-09 17:20:45
真核表达的是二聚体吧，还原电泳看看。

非常感谢！我不太懂这个二聚体是怎么回事，如果是二聚体的原因，跑还原性电泳，再转膜做western就能是原来预测的大小吗？
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3楼2016-05-09 17:47:36
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小周

铁杆木虫 (著名写手)
可以！你可以做一个还原的，一个非还原的对着看。

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4楼2016-05-09 19:38:39
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lrxczy

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 小周 at 2016-05-09 19:38:39
可以！你可以做一个还原的，一个非还原的对着看。

我现在做的就是变性的电泳，但是变性电泳应该是把蛋白的结构都打开了啊，如果有二聚体也应该是打开的呀，还原性电泳不变性，更应该是二聚体折叠的结构吧……

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5楼2016-05-09 20:05:46
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小周

铁杆木虫 (著名写手)
还原的意思是打开二硫键

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6楼2016-05-09 20:20:57
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lrxczy

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 小周 at 2016-05-09 20:20:57
还原的意思是打开二硫键

我现在做的SDSPAGE就是处理样品时加巯基乙醇的，不是打开二硫键了吗

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7楼2016-05-09 22:36:57
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小周

铁杆木虫 (著名写手)
你查查你的蛋白是不是糖蛋白，糖基化程度多高？原核里没有翻译后修饰。

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8楼2016-05-10 05:46:28
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lrxczy

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 小周 at 2016-05-10 05:46:28
你查查你的蛋白是不是糖蛋白，糖基化程度多高？原核里没有翻译后修饰。

谢谢！我分析过后应该怎样验证呢？是不是糖蛋白，是不是二聚体，应该用什么样的实验方法验证？

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9楼2016-05-11 06:54:39
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