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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 细胞科学 » 质粒酶切回收
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Mandy 王曼曼

新虫 (初入文坛)

[交流] 质粒酶切回收 已有6人参与

PLKO.1质粒9000bp，双酶切出7000bp和2000bp的片段，跑电泳（1%琼脂糖）条带正确且清晰，回收质粒用的TIANGEN的，回收后测浓度和吸光值，D260/D280只有1.5甚至更低，操作很小心，好几次都这样，找不到原因，求帮助分析下。谢谢了！
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1楼 2016-05-05 21:20:21
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
天根胶回收产物直接吸光法测浓度，有的时候会有很大误差，回收产物中残留多糖影响吸光法定量，不如跑个电泳看下。
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2楼2016-05-05 23:08:32
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张凡云

至尊木虫 (职业作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
是你本来酶切的量不够吗？你切了多大体系，回收最后多少洗脱的

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3楼2016-05-06 09:02:18
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Mandy 王曼曼

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by stone2239 at 2016-05-05 23:08:32
天根胶回收产物直接吸光法测浓度，有的时候会有很大误差，回收产物中残留多糖影响吸光法定量，不如跑个电泳看下。

您是说，回收的那部分再跑个电泳吗？
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4楼2016-05-06 10:00:59
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Mandy 王曼曼

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 张凡云 at 2016-05-06 09:02:18
是你本来酶切的量不够吗？你切了多大体系，回收最后多少洗脱的

量是够的，50ul的体系，4ug的质粒，50ul  洗脱的。浓度也还好，11ng/ul，就是吸光值有问题。D260都没峰。
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5楼2016-05-06 10:05:15
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)
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4楼: Originally posted by Mandy 王曼曼 at 2016-05-06 10:00:59
您是说，回收的那部分再跑个电泳吗？...

对，一般上样2ul就可以。
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6楼2016-05-06 12:57:41
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Mandy 王曼曼

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by stone2239 at 2016-05-05 23:08:32
天根胶回收产物直接吸光法测浓度，有的时候会有很大误差，回收产物中残留多糖影响吸光法定量，不如跑个电泳看下。

回收的7000bp又跑电泳，结果如图所示：左边是样，右边是marker（最上面为7000bp）。7000bp处有条带，但是有拖尾，这意味着被降解了吗？
质粒酶切回收
~27H%ONRBMQ1YMZ2OW32[7O.png
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7楼2016-05-06 13:05:03
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stone2239

铁杆木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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7楼: Originally posted by Mandy 王曼曼 at 2016-05-06 13:05:03
回收的7000bp又跑电泳，结果如图所示：左边是样，右边是marker（最上面为7000bp）。7000bp处有条带，但是有拖尾，这意味着被降解了吗？

~27H%ONRBMQ1YMZ2OW32[7O.png
...

可以继续往下做，没有问题。
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8楼2016-05-06 13:13:48
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wchuangqi

铜虫 (小有名气)
★
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感觉问题不大，可以在回收的时候增加一步wash,看看260/280会不会好点
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天道酬勤
9楼2016-05-07 00:23:29
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cvbst

新虫 (小有名气)
★
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胶回收产物用电泳鉴定就行了，以后别用紫外检测了。

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10楼2016-05-07 09:20:54
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