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shenjie4235木虫 (初入文坛)
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[交流]
求助分子生物学实验题
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、假设你需要将一段 cDNA 克隆到表达载体中并转化到大肠杆菌中。cDNA 的两端和载体上均有 BamHI 的酶切位点，你需要用 BamHI 切割 cDNA 和载体然后将它们连接在一起。下面是实验方法要求的具体步骤： a. 用 BamHI 处理载体DNA，然后用碱性磷酸酶去除5′端的磷酸基； b. 用BamHI处理cDNA，然后与步骤a中得到的载体DNA混合，加入DNA聚合酶，在适当的条件下使 cDNA 与载体连接； c. 将步骤b的产物转入大肠杆菌感受态细胞中，培养后均匀涂在含有抗生素的琼脂培养皿上。因为表达载体中含有抗性基因，能表达抵制抗生素的酶，所以只有含有载体的大肠杆菌才可以在含有抗生素的培养皿上生长，而未被转化的细菌则因受到抗生素的抑制而死掉。你还参照实验手册做了下面四组对照： 对照一、在含有抗生素的培养皿上面涂布未被转化的（即不含有载体的）大肠杆菌感受态细胞（cells alone）。 对照二、用未被酶切的载体直接转化大肠杆菌感受态细胞，将产物涂布在含有抗生素的培养皿上面（vector alone）。 对照三、用 BamHI 酶切载体 DNA 后，不用碱性磷酸酶处理，不需要 cDNA，直接加入 DNA 聚合酶，然后转化、涂板(Omit phosphatase, omit cDNA)。 对照四、除使用碱性磷酸酶外，其它与对照三相同 (Omit cDNA)。 你一共做了三次实验，在第一次中所有的平板中都长出很多细菌。在第二次实验中所有的平板中都没有长细菌。在第三次实验中你得到了较好的结果，转化成功，具体克隆数见下表： Preparation of Sample No. of Colonies 1 2 3 Control 1 Cells alone TMTC 0 0 Control 2 Uncut vector TMTC 0 >1000 Control 3 Omit phosphatase, omit cDNA TMTC 0 435 Control 4 Omit cDNA TMTC 0 25 Experimental sample TMTC 0 34 TMTC=too many to count 请回答下列问题： A. 试解释第一次实验失败的原因，并说明对照一的目的是什么； B. 解释第二次实验失败的原因，并说明对照二的目的是什么； C. 对照三和对照四的目的是什么？为何手册上建议用碱性磷酸酶处理载体？ [ Last edited by zhangwj on 2008-12-19 at 00:14 ] |
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