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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 分类/鉴定 » 16sRNA测序相关实验步骤和方法
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Mr_左撇子

新虫 (初入文坛)

[求助] 16sRNA测序相关实验步骤和方法 已有5人参与

本人最近筛选出一个单菌落，需要用到16sRNA测序，但之前没有接触过此类实验，不知如何操作，希望大神能指点一二。

@天使托 发自小木虫Android客户端
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1楼 2016-04-29 22:58:57
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happy6

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

可以找一些相关研究的硕士或者博士论文看一下。
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2楼2016-05-03 13:15:10
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杜明珠

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

这是我们实验室鉴定菌种所用测序的方法，你可以参考一下。

ITS序列扩增与TEF-1α序列扩增
将模板DNA分别进行ITS序列与TEF-1α序列的扩增。引物序列见下表3：
表3 引物序列
Primer                               5’- 3’
ITS1                             TCCGTAGGTGAACCTGCGG
ITS4                             TCCTCCGCTTATTGATATGC
Ef728M                            CATCGAGAAGTTCGAGAAGG
Tef1αR                           GCCATCCTTGGGAGATACCAGC
   
ITS序列PCR反应体系：
10xBuffer        2.5μL
Mg2+        2μL
ITS1        1.5μL
ITS4        1.5μL
dNTP        2μL
Taq        0.5μL
模板        1μL
ddH2O        14μL
Total        25μL
      
ITS序列PCR程序：

94℃        5min
94℃        30s
50℃        30s
72℃        60s
72℃        10min
4℃        ∞
      
     TEF-1α序列PCR反应体系：
10xBuffer        2.5μL
Mg2+         2μL
Ef728M        1.5μL
Tef1R        1.5μL
dNTP               2μL
Taq             0.5μL
模板           1μL
ddH2O        14μL
Total        25μL

TEF-1α序列PCR程序：
94℃        5min
94℃        45s
52℃        45s
72℃        60s
72℃        10min
4℃        ∞


PCR产物直接送去测序。
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天天开心
3楼2016-05-04 11:32:49
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Liumengya

木虫 (正式写手)
细菌提dna直接送公司，一个样品18元。楼下实验室就这样做的

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4楼2016-05-04 23:56:30
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Mr_左撇子

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 杜明珠 at 2016-05-04 11:32:49
这是我们实验室鉴定菌种所用测序的方法，你可以参考一下。

ITS序列扩增与TEF-1α序列扩增
将模板DNA分别进行ITS序列与TEF-1α序列的扩增。引物序列见下表3：
表3 引物序列
Primer                            ...

想问一下，我分离出来的菌落我怎么证明它是单一菌落呢？

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5楼2016-05-11 00:15:59
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fang8232335

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by Mr_左撇子 at 2016-05-11 00:15:59
想问一下，我分离出来的菌落我怎么证明它是单一菌落呢？
...

如果不是单菌落，你用16S通用引物扩增出来的是不一样的，如果是直接片段送测序可能会有套峰，如果是用T/A克隆后测序，可能会得到不一样的多条16S

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6楼2016-05-11 13:51:18
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Mr_左撇子

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by fang8232335 at 2016-05-11 13:51:18
如果不是单菌落，你用16S通用引物扩增出来的是不一样的，如果是直接片段送测序可能会有套峰，如果是用T/A克隆后测序，可能会得到不一样的多条16S
...

那么在做16sRNA之前，应该对菌做什么处理呢？菌应该纯化到什么程度？请大神指点。

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7楼2016-05-12 08:31:35
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e生物圈

捐助贵宾 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ...
silicare: 金币-200, 屏蔽内容, 违规存档, 再发这种毫无价值千篇一律的纯广告帖子，就只能封号了 2016-05-25 11:37:13
本帖内容被屏蔽
8楼2016-05-17 09:57:17
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zhangyl2017

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by Liumengya at 2016-05-04 23:56:30
细菌提dna直接送公司，一个样品18元。楼下实验室就这样做的

请问有那个公司能从细菌中提取基因组呢？

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9楼2017-05-25 15:27:40
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