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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 最近做重组PCR，共五个片段，最终把全长扩出后做模板就扩不出了
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bealady

铜虫 (正式写手)

[求助] 最近做重组PCR，共五个片段，最终把全长扩出后做模板就扩不出了

前四个片段较小，分别有170；150；110和160，是逐一进行片段重组的，因为片段2和4同源性太高，四个重组完成后进行了TA克隆，测序后证明这四个片段成功重组，
可是，重点来了，
我第五个片段长1894bp，从克隆载体上扩下来的上述片段再与第五个片段重组，Okay，有清晰特异明亮的条带，且长度上相一致，
这个时候还好啊，我就又进行了TA克隆，问题来了，抗性的板子上长出很多菌落，我挑出10个菌落做菌P，只有两个是阳性，用的是我扩增全长的引物，（这个时候是怀疑的，TA克隆不至于这么低吧），再提质粒，酶切显示只是个空载体，求大神指示，哪里出了问题了啊……

还有一个值得关注的问题，我再以扩出全长（五个片段组装完成）的产物做模板，用最上游和最下游引物，再次进行PCR的时候，没有特异带，完全弥散，急求指点
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Spideman，13-23
1楼 2016-04-26 10:12:54
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愤怒的小怪兽

新虫 (初入文坛)
你的问题解决了么？我也遇到了差不多的问题

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2楼2017-04-27 13:58:25
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saveline

新虫 (初入文坛)
是连接反了吗

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3楼2017-06-20 10:47:14
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