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最近做重组PCR，共五个片段，最终把全长扩出后做模板就扩不出了
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前四个片段较小，分别有170；150；110和160，是逐一进行片段重组的，因为片段2和4同源性太高，四个重组完成后进行了TA克隆，测序后证明这四个片段成功重组， 可是，重点来了， 我第五个片段长1894bp，从克隆载体上扩下来的上述片段再与第五个片段重组，Okay，有清晰特异明亮的条带，且长度上相一致， 这个时候还好啊，我就又进行了TA克隆，问题来了，抗性的板子上长出很多菌落，我挑出10个菌落做菌P，只有两个是阳性，用的是我扩增全长的引物，（这个时候是怀疑的，TA克隆不至于这么低吧），再提质粒，酶切显示只是个空载体，求大神指示，哪里出了问题了啊…… 还有一个值得关注的问题，我再以扩出全长（五个片段组装完成）的产物做模板，用最上游和最下游引物，再次进行PCR的时候，没有特异带，完全弥散，急求指点 |
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