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[求助]
求帮助！！！求告知关于做膜蛋白的表达，分离和纯化的具体步骤！！！已有2人参与
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 我正在做变形菌视紫红质在重组细胞上的表达，纯化和分离的本科毕业论文。感受态细胞是大肠杆菌，对于我是零基础重新开始，我完全是菜鸟一个，可以告诉我详细的纯化，分离做法吗？尤其是用qiagen公司的NI-NTA Agarose 25ML做柱层析，怎么装柱，装多少，怎么洗？我知道用蛋白浓度算填料多少，可是蛋白浓度怎么得到？我现在只做到了诱导蛋白在重组细胞上表达了。麻烦一定要详细一点简单一点，我这是第一次接触生物化学，本科是学化学的55555555.。。。。。。。。。。。。谢谢了，急用！！！！！ |
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【答案】应助回帖
| 那个，我先告诉你，如果是膜蛋白的话，用原核大肠杆菌系统是没法做的，全球基本上是没有人能够用大肠杆菌系统表达出膜蛋白的，膜蛋白用真核表达系统才能表达，用哺乳动物细胞表达或酵母蛋白表达都可以，就算现在有人用大肠杆菌表达出膜蛋白了，那你是没有经验的也很难，再说蛋白表达的过程太长考虑的点太多，从基因序列密码子优化，载体选择，感受态选择，表达条件优化等每个过程都有要注意的点，但是现在你的第一步是选择合适的表达系统，可以参考资料：蛋白表达专题，包括原理，SOP相关FAQ：http://www.detaibio.com/topics/dan-bai-biao-da.html |
6楼2016-04-27 16:57:51
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装柱你有空柱子吗？有的话，把填料混匀直接加到柱子里就可以了，然后用蠕动泵或者重力都可以，让液面缓慢下降到填料上界面时，加平衡液平衡填料，再然后把你提到的细胞粗提物加到填料里，接着用平衡液再次洗柱子，然后用含咪唑的平衡液洗填料的同时接洗脱液。洗脱液里就有你要的蛋白。蛋白浓度可以测A280的吸光值来确定，或者有BCA蛋白浓度测定试剂盒也可以 发自小木虫Android客户端 |
2楼2016-04-25 19:38:20
3楼2016-04-26 11:05:08
4楼2016-04-26 20:59:08