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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » 求帮助！！！求告知关于做膜蛋白的表达，分离和纯化的具体步骤！！！
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wo00wo2

新虫 (初入文坛)

[求助] 求帮助！！！求告知关于做膜蛋白的表达，分离和纯化的具体步骤！！！ 已有2人参与

我正在做变形菌视紫红质在重组细胞上的表达，纯化和分离的本科毕业论文。感受态细胞是大肠杆菌，对于我是零基础重新开始，我完全是菜鸟一个，可以告诉我详细的纯化，分离做法吗？尤其是用qiagen公司的NI-NTA Agarose 25ML做柱层析，怎么装柱，装多少，怎么洗？我知道用蛋白浓度算填料多少，可是蛋白浓度怎么得到？我现在只做到了诱导蛋白在重组细胞上表达了。麻烦一定要详细一点简单一点，我这是第一次接触生物化学，本科是学化学的55555555.。。。。。。。。。。。。
谢谢了，急用！！！！！
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1楼 2016-04-18 08:59:05
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moychan

银虫 (小有名气)
装柱你有空柱子吗？有的话，把填料混匀直接加到柱子里就可以了，然后用蠕动泵或者重力都可以，让液面缓慢下降到填料上界面时，加平衡液平衡填料，再然后把你提到的细胞粗提物加到填料里，接着用平衡液再次洗柱子，然后用含咪唑的平衡液洗填料的同时接洗脱液。洗脱液里就有你要的蛋白。蛋白浓度可以测A280的吸光值来确定，或者有BCA蛋白浓度测定试剂盒也可以

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2楼2016-04-25 19:38:20
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wo00wo2

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by moychan at 2016-04-25 19:38:20
装柱你有空柱子吗？有的话，把填料混匀直接加到柱子里就可以了，然后用蠕动泵或者重力都可以，让液面缓慢下降到填料上界面时，加平衡液平衡填料，再然后把你提到的细胞粗提物加到填料里，接着用平衡液再次洗柱子，然 ...

谢谢这位虫子，你是第一个回复我的
我还想问一下因为过柱子时间特别长，两种进液直接可以间断吗？间断的时候进液如何保存呢？柱子呢？怎么保存？如果一直连续过柱子我怕我累死在实验台上啊。。
求告知！不胜感激！！！
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3楼2016-04-26 11:05:08
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moychan

银虫 (小有名气)
可以间断，但是温度最好保持在4℃，如果不能，粗提物加入后最好在最短的时间里洗脱蛋白，时间越长降解越多

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4楼2016-04-26 20:59:08
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moychan

银虫 (小有名气)
间断的时候只要保持柱子中液面在填料之上就可以，柱子可以直接闭合后放4℃冰箱

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5楼2016-04-26 21:01:16
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wochong

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

那个，我先告诉你，如果是膜蛋白的话，用原核大肠杆菌系统是没法做的，全球基本上是没有人能够用大肠杆菌系统表达出膜蛋白的，膜蛋白用真核表达系统才能表达，用哺乳动物细胞表达或酵母蛋白表达都可以，就算现在有人用大肠杆菌表达出膜蛋白了，那你是没有经验的也很难，再说蛋白表达的过程太长考虑的点太多，从基因序列密码子优化，载体选择，感受态选择，表达条件优化等每个过程都有要注意的点，但是现在你的第一步是选择合适的表达系统，可以参考资料：蛋白表达专题，包括原理，SOP相关FAQ：http://www.detaibio.com/topics/dan-bai-biao-da.html
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6楼2016-04-27 16:57:51
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hc2015

新虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
nono2009: 金币-20, 屏蔽内容, 违规存档, 注册商家也只能在广告区发广告，其它区发广告仍属违规 2016-05-05 22:05:09
本帖内容被屏蔽
7楼2016-05-04 10:24:19
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