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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 去磷酸化
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幻缕

新虫 (初入文坛)

[交流] 去磷酸化 已有5人参与

如果要让酶切后的载体和片段连起来，则片段要去磷酸化，为什么质粒不用去磷酸化呢？还有，去磷酸化之后的片段和载体怎么连成完整的环状？而不是只能连一端？

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1楼 2016-04-17 23:22:40
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liuderong

铁杆木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你在什么地方看到需要去磷酸化才能做链接的？
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2楼2016-04-18 17:36:04
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star013

新虫 (知名作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你这是平端连接吧？

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3楼2016-04-18 18:30:03
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幻缕

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by liuderong at 2016-04-18 17:36:04
你在什么地方看到需要去磷酸化才能做链接的？

我们实验室做连接实验之前会让片段去磷酸化防止自连，可是一直不明白，是不是不需要去磷酸化啊？

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4楼2016-04-19 18:16:11
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幻缕

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by star013 at 2016-04-18 18:30:03
你这是平端连接吧？

嗯嗯，是的

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5楼2016-04-19 18:19:52
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幽幽小草

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
一般好像都是单酶切需要去磷酸化防止自连

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6楼2016-04-19 19:06:55
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liuderong

铁杆木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
4楼: Originally posted by 幻缕 at 2016-04-19 18:16:11
我们实验室做连接实验之前会让片段去磷酸化防止自连，可是一直不明白，是不是不需要去磷酸化啊？
...

去磷酸化后确实可以防止载体或者片段自连，减少后续筛选步骤的难度。不过这个步骤不是必须的。
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7楼2016-04-20 08:52:22
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star013

新虫 (知名作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我们可以做这个技术服务，

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8楼2016-04-20 09:10:45
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玉兔Jane

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
7楼: Originally posted by liuderong at 2016-04-20 08:52:22
去磷酸化后确实可以防止载体或者片段自连，减少后续筛选步骤的难度。不过这个步骤不是必须的。...

同意，质粒去磷酸化可以降低假阳性的概率。
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9楼2016-04-20 13:14:45
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原海亮

木虫 (著名写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
为什么我们是相反的，片段一般不需要磷酸化，因为片段本身自连，即使能转化进去，也是不会生长的，因为它没有携带复制元件，抗性筛选等基因。而载体进行去磷酸化，可以显著降低假阳性的出现，要知道质粒载体自连是可以在感受态里自助复制，并影响你后续筛选克隆的。对于去磷酸化后连接是否完整，这个你可以去看看去磷酸化的原理，理论上好像是会有一个缺口，进入宿主后会被填补。

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天空才是极限，我有信心飞的更高！
10楼2016-04-20 21:01:42
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