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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求助 关于PCR
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sunmaocai

铜虫 (小有名气)

[交流] 求助 关于PCR

哪位大侠帮帮忙，我跑PCR跑不出我想要的条带，只要在MARKER的100bp以内有一条清晰的带，而我要的是1300bp的，做了好多回，也跑过梯度，结果还是一样，为什么啊？拜求！
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1楼 2008-10-22 13:38:56
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zjlxylw

铁杆木虫 (正式写手)
楼主说的什么意思啊？没看懂
你做的是什么试验啊？
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2楼2008-10-22 14:23:11
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chenliang_0513

铁杆木虫 (职业作家)
★
司马诸葛(金币+1,VIP+0):谢谢交流 8-2 21:38
100bp？那是什么啊 ，引物二聚体还是应该1000bp以内？
引物没有设计好重新设计引物
或者你提高退火温度，可以减少非特意扩增
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我本将心向明月,奈何明月照沟渠?
3楼2008-10-22 14:38:13
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helenfang

铜虫 (小有名气)
★
司马诸葛(金币+1,VIP+0):谢谢交流 8-2 21:39
楼上说的对，我也觉得100bp以内的可能是引物二聚体，得考虑下是不是引物设计错了
提高退火温度我估计没什么用，本来就没有目的片度了，提高了应该没有了吧我想
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4楼2008-10-22 15:24:24
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恒星年

银虫 (正式写手)
★
司马诸葛(金币+1,VIP+0):谢谢交流 8-2 21:39
100bp左右的应该是引物二聚体，跑个对照组（不加模板），如果是引物二聚体的话应该还会出现。
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5楼2008-10-22 17:18:52
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jbhu220

铁杆木虫 (职业作家)
★
司马诸葛(金币+1,VIP+0):谢谢交流 8-2 21:39
同意楼上的意见。但你跑的带很大，1300bp太大可能难以得到。不知道你跑的是不是SSR，若是自己设计的引物可能中间有内含子
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6楼2008-10-22 20:29:48
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amberking

★
司马诸葛(金币+1,VIP+0):谢谢交流 8-2 21:40
同学，100bp以内应该是引物二聚体了
你还是降低退火温度吧，要是到50度左右还扩不出来你先检查模板再检查下引物吧
恩，还有个事情就是比较让人冒火的，就是公司给合成的引物有问题，那个得测序证明
PRIMER3评价下你的引物，引物单子对一下是不是你给人家提呈的时候碱基有问题
你的阳性对照能出来不？
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7楼2008-10-23 14:48:52
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三磷酸腺苷

铁杆木虫 (职业作家)
1、重新设计引物（dimer自由能最好别超过-10kcal/mol）
2、使用热启动酶，我试过热启动酶，发现可以大大降低dimer的量
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8楼2008-10-23 15:36:32
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shs304

金虫 (正式写手)
这里一发帖，问题一般都能解决！
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9楼2008-10-23 15:45:01
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