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WB结果 请教
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本人新手刚开始做，总是出现背景高，膜花花的情况 共有两个目的蛋白一个内参。 流程：1.10ul上样量，80v，120v电泳。 2.半干转膜20v，1h（操作中发现膜剪得比胶大太多，不知是否有影响），缓冲液浸透滤纸。 3.5%脱脂奶粉25度封闭3h（由于之前做的背景高选择封闭时间加长，之前一次37度2h），摇床震荡。 4.一抗4度摇床孵育过夜，浓度两个目的蛋白均为1：2000，内参1：5000（也是由于之前背景高，一抗浓度由1：1000变为1：2000，以封闭液稀释） 5.tbst洗涤10min*4次 6.二抗1：10000，室温1h（18度左右，也是由于背景高尝试的，之前37度2h） 7.tbst洗涤10min*4次 8.ecl曝光（蛋白1.蛋白2可能有曝光液太多的情况，没有吸干，不知是否有影响） 贴上结果图，希望大神们可以指导一下为什么会出现这些情况（PTEN出现条带但是很花，p53是直标一抗但也加了二抗还是没有条带，是否抗体不好，gapdh比较好看）  20160329.gadph.JPG  20160329.p53.JPG  20160329.pten.JPG |
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liyushan1130
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