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菜头Q

铜虫 (初入文坛)

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小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
圆加leaf: 金币+10, 非常感谢! 2016-04-26 09:18:56
我按照实验进行的思路跟你分享一下我的想法。
1.提取目的基因mRNA,用逆转录试剂盒进行逆转录,此时你得到是和你mRNA等量的cDNA.
2.根据mRNA的序列信息,用primer 5.0设计出特异性扩增引物对(考虑公司合成和到手时间,建议先做这个,最好一次做两组以上)。
3.用设计出来的特异性扩增引物对cDNA模板进行PCR扩增,这一步的步骤是为了扩增目的片段并加上与T载配对的A尾。
4.PCR产物可用PCR纯化试剂盒进行纯化。
5.纯化得到的PCR产物按照TA克隆试剂盒的体系进行连接转化,用PCR的方法筛选得到阳性重组子。
6.扩增阳性菌株,提质粒,送测序。测序结果符合预期的甘油保菌。
PS:逆转录试剂盒的作用是把RNA进行逆转录,得到与之互补的cDNA链。TA克隆试剂盒一般有T载体、感受态和鉴定引物,是为了帮助你在不用酶切的条件下得到阳性重组子,且该方法鉴定起来更简单,无需酶切,只看电泳结果就能一目了然。
11楼2016-04-25 21:04:49
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