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ks15pyqiii

铜虫 (初入文坛)

[交流] SSR重复性不好

我的试验重复性不好,我做的是SSR引物的筛选,把其它物种上SSR的引物应用到泡桐上,筛选出来一些条带清晰的引物,但同一对引物同一条件下有时扩增出条带数不一致,有时无产物。小妹快毕业了,急啊!请高手指教!
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jbhu220

铁杆木虫 (职业作家)

这种情况不应该是PCR仪的问题,我原来用进口的,现在用国产的,效果都还不错。可能是反应体系的问题。1,反应体系最好用一般化的,各物质的浓度不能过高过低;2,提高TM值,一般在55度或以上;如带条较小<100bp,可用10~12%变性聚丙烯酰胺
3楼2008-10-20 11:01:48
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天涯海角

木虫 (著名写手)

害群之牛

ssr的稳定性应该不错,你最好换一台pcr仪,试一试,因为我也遇到过这种情况,我当时是pcr仪器不稳定的问题,当然分子标记许多重复性不是很好!
井底之蛙也可笑看天下
2楼2008-10-19 19:04:21
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ks15pyqiii

铜虫 (初入文坛)

谢谢一楼二楼的朋友!
我用的PCR仪是德国Biometra的,两台是同一型号的,差别应该很小吧?我试过用同一台PCR仪也不稳定。我用的是降落PCR,TM值从65度到55度,条带都很清晰,都在100bp左右,用6%的变性聚丙烯酰胺就可以检测的到。我在同一次 试验中的重复是一致的,在两次试验中重复有时就有差异了,会不会是我加的体系不准确啊?我用的是PCR版,先把模板等相同的成分全部在加样槽里混匀后再加到PCR板里,最后逐个加引物。没有再混匀也没离心,会不会有影响啊?还有我用这种方法筛选出来的引物会不会本身就不稳定,容易引起错配啊?
4楼2008-10-20 18:27:26
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