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xxz紫桐

铜虫 (初入文坛)

[求助] 双重PCR体系优化 已有1人参与

麻烦各位帮我看看，两对引物，一对较长，短的引物是结合在另外一对长的引物上的，做过几次试验，刚开始是先用长的引物扩的，目的条带都有出来，可是最近几次，结合短的引物时目的条带没有出来，浓度比也比较过，也有试着调整退火温度之类的，但拖带很明显，没办法确定目的条带。所以现在不知道该怎么优化了。扩增体系是根据之前长的引物确定好的。
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1楼 2016-03-15 14:14:26
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zhifang889
哦。

发自小木虫Android客户端
2楼2016-03-15 14:24:11
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卡维斯

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
确保引物质量，没有降解。试试将长引物产物稀释十倍再用，且不要长时间放置。短退火需要在调整，引物引物不一样了。
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3楼2016-03-15 14:30:40
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xxz紫桐

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 卡维斯 at 2016-03-15 14:30:40
确保引物质量，没有降解。试试将长引物产物稀释十倍再用，且不要长时间放置。短退火需要在调整，引物引物不一样了。

引物质量肯定是没有问题的，长引物有试着稀释了，按照不同的倍数稀释的，1倍，10倍，100倍的，甚至1000倍的都有试过，可就是只有1倍的有出来条带，但不是很明显，而且担心并不是要的条带，毕竟条带大小差不多。至于退火温度的，之前有先用一个退火时间梯度进行试验，退火温度没变化，出现的结果就是拖带很严重，是不是得先用较小的退火温度试下呢，那循环数多少才比较合适呢？长的引物退火温度大概在58度左右，短的引物大概在60度左右。
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4楼2016-03-15 14:51:54
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卡维斯

金虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by xxz紫桐 at 2016-03-15 14:51:54
引物质量肯定是没有问题的，长引物有试着稀释了，按照不同的倍数稀释的，1倍，10倍，100倍的，甚至1000倍的都有试过，可就是只有1倍的有出来条带，但不是很明显，而且担心并不是要的条带，毕竟条带大小差不多。至于 ...

试试在长引物的PCR产物检测有带后，将其纯化一下，有相关的PCR产物纯化试剂盒可用，然后稀释稀释10倍，这样应该可以避免拖尾问题。由于是二次PCR所以循环数不用太多，正常32就可以
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5楼2016-03-15 15:43:14
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xxz紫桐

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 卡维斯 at 2016-03-15 15:43:14
试试在长引物的PCR产物检测有带后，将其纯化一下，有相关的PCR产物纯化试剂盒可用，然后稀释稀释10倍，这样应该可以避免拖尾问题。由于是二次PCR所以循环数不用太多，正常32就可以...

哦，那我试试看，谢谢，嘻嘻。
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6楼2016-03-15 16:12:51
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xxz紫桐

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 卡维斯 at 2016-03-15 15:43:14
试试在长引物的PCR产物检测有带后，将其纯化一下，有相关的PCR产物纯化试剂盒可用，然后稀释稀释10倍，这样应该可以避免拖尾问题。由于是二次PCR所以循环数不用太多，正常32就可以...

我按照你说的试验了下，退火温度降到了54度，时间也变长了，目的条带有些出来了，条带不是很亮，但非特异性条带也有，这个问题要怎么解决呢？还有，一对长引物，直接扩增非特异性条带很多，但结合短引物后，目的条带没有扩出来，有没有什么办法可以改善的呢？产物纯化是可以，但目的条带也不是很明显。
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7楼2016-03-16 17:38:40
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xxz紫桐

铜虫 (初入文坛)
xxz紫桐: 回帖置顶 2016-03-18 09:06:45
想问下，原本不应该出现条带的，会因为什么因素出现呢？污染？还是？
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8楼2016-03-18 09:06:31
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