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xuehu2008

铜虫 (正式写手)

[交流] 求助关于RT-PCR

各位大侠,
我的RT-PCR结果今天出来了,p了两遍,可是条带大小连目标片段的一般都不到,不知是什么原因啊?是RT的问题还是总RNA提取的问题?我的RT步骤为:
1.总RNA和反义引物混合,70度5min——4度5min——冰上。
2.将以上的模板和引物加入反转录体系,按照Promega的操作说明。
3.25度5min——42度60min——70度15min
4.取第三步反应产物作为PCR的模板,假如一对引物和Taq酶扩增。

求高手帮忙看看。
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cdl007

木虫 (正式写手)

将control加进去
一般试剂盒都有的,是通用引物的
如果出来了是你的引物有问题
如果出不来也许是RT也许是总RNA降解
后者可能性更大
2楼2008-10-16 22:55:40
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xuehu2008

铜虫 (正式写手)

问题是,我买的不是试剂盒,只有反转录酶啊,怎么办?
3楼2008-10-16 23:21:20
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米见方ggsddu

金虫 (小有名气)

only屋里哇啦

RNA提出来后进行核酸定量,就可以知道是不是RNA的问题
低调潜行
4楼2008-10-19 00:57:54
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米见方ggsddu

金虫 (小有名气)

only屋里哇啦

不过你的反转录步骤好复杂啊,promega的MMLV步骤很简单,你可以试试
低调潜行
5楼2008-10-19 01:01:45
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xuehu2008

铜虫 (正式写手)

又做了一次,和上次结果一模一样,认为可以排除RNA降解的问题了,估计是引物问题吧
6楼2008-10-19 13:32:06
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