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[求助]
过表达载体的构建
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我是个本科小白。对实验一窍不通，最近想弄清楚“”用转基因拟南芥分析外源基因功能“”类似实验的原理、方法技术和步骤。希望师兄师姐指出我的错误：目的基因有两个转录本，①先提取总mRNA，②用RT-PCR扩增cDNA，电泳回收。③产物与pMD18-T载体连接，转化大肠杆菌，挑选阳性克隆。④培养提取重组质粒然后与pCAMBIA1301质粒进行双酶切《这里我搞不懂，双酶切后pMD18-T载体是否还在上面，还是酶切之后只剩下需要的目的基因了，求前辈解答》。⑤酶切产物进行电泳回收然后连接。⑥转化农杆菌GV3101《请问怎么筛选出转化成功的农杆菌呢？》⑦农杆菌侵染拟南芥⑧抗性筛选转化子。PS：我是小白，问的不对的地方，望见谅，我想自己设计一个实验过程，求帮忙，谢谢！ 发自小木虫Android客户端 |
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5楼2016-03-16 00:42:00
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引物需要加酶切为点，与1301的为点对应，注意选的酶切为点序列上不能有。T载体最好用sample吧。酶切后只回收你的目的片段，载体片段不要回收，关于你的问题酶切就是两刀两段，你的目的片段一段，载体一段。然后连在1301上就行。 发自小木虫Android客户端 |
2楼2016-03-13 16:10:21
3楼2016-03-15 11:12:55
star013 
新虫 (知名作家)
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4楼2016-03-15 12:55:25