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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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xuehu2008

铜虫 (正式写手)

[交流] 求教关于RT-PCR

我第一次做RT-PCR,没有买到完整的试剂盒,只买到了反转录酶,是promega的,没有oligo-dT或随即引物,本想做两步法看来是不成啦,只好把一步法当成两步来做。
求教先做RT时加入的引物是一对好呢还是只加反义引物,网上两种说法都有。再者,说明书给出的RT步骤为:25度*5min——42度*60min——70度*15min,是在水浴锅中好呢还是要放到PCR仪上?
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h8872410kong

金虫 (小有名气)

肯定是放PCR上
不过引物看你做的什么了,目标片段长度什么的都有点影响
2楼2008-10-15 00:13:49
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zhongdianshi

银虫 (小有名气)

没有PCR,水浴也能对付。不知道你要得到什么?RT应该是一对引物吧。
引用回帖:
Originally posted by xuehu2008 at 2008-10-14 21:47:
我第一次做RT-PCR,没有买到完整的试剂盒,只买到了反转录酶,是promega的,没有oligo-dT或随即引物,本想做两步法看来是不成啦,只好把一步法当成两步来做。
求教先做RT时加入的引物是一对好呢还是只加反义引物 ...

3楼2008-10-15 06:27:17
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bbcaaa888

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by xuehu2008 at 2008-10-14 21:47:

求教先做RT时加入的引物是一对好呢还是只加反义引物 ...

先做RT只加反义引物好一点,虽然加一对也没有大碍,不过实验总是希望减少不必要的麻烦,能简单就简单;

使用PCR仪比较方便。
4楼2008-10-15 09:19:04
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xuehu2008

铜虫 (正式写手)

好的,谢谢大家的指点!
5楼2008-10-15 11:13:22
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xuehu2008

铜虫 (正式写手)

我的目标片段大概五百多bp,引物是Primer premier5.0设计的特异性引物
6楼2008-10-15 11:14:49
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imzhangguo

铁杆木虫 (初入文坛)

使用一对引物,由于引物是由软件设计出来的,应该可以排除自身二聚体和引物二聚体的形成,RT-PCR的结果是特异引物被优势扩增。
使用PCR仪进行RT,效果较好,因为实验过程稳定,可重复性好,可控性好。
另外提醒楼主的是,做RT时,一定有快,因为RNA在实验体系降解的速度很快。
最后,祝楼主实验成功!
7楼2008-10-15 11:23:07
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xuehu2008

铜虫 (正式写手)

谢谢imzhangguo  的指点!
8楼2008-10-15 12:37:09
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