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elina_zj新虫 (初入文坛)
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构建3k多bp的载体 已有1人参与
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| 求助！最近要构建一个加flag标签的3000多bp的载体，还有酵母双杂载体，求大牛们指教，构了两次没有成功。 |
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【答案】应助回帖
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西门吹雪170: 金币+4, 鼓励回帖交流 2016-03-07 10:22:37
西门吹雪170: 金币+4, 鼓励回帖交流 2016-03-07 10:22:37
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大概了解了（当然不知道没有成功，是没有转化子生长？还是有转化子生长但都是空载？还是有转化子生长但是结果乱七八糟），一般普通克隆需要注意的:1.开始阶段引物的设计，包括酶切位点选择和保护碱基，看你描述，应该是拿到了正确的目的条带，问题不大。2.载体和目的片段双酶切处理，这应该是连接效率的关键，pcr产物酶切对于有些酶效率相对不高，可以适当增加酶量和酶切时间，载体如果是空载出发进行酶切，建议做同样出来，尽量保证酶切完全。3.连接体系，这个连接前，最好对回收的目的片段和载体的浓度进行检测，对两者之间的比例有个指导作用。4.转化，如果前面几步没太大问题，转化一般不会影响太大，当然感受态效率及是否污染会有影响，当然筛选出来几个阳性克隆还是可以满足的。 发自小木虫Android客户端 |
6楼2016-03-06 23:34:03
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7楼2016-03-06 23:51:51
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