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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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amberhwk

新虫 (小有名气)

[交流] 连接转化

和PMD-19T载体连接 体系10 载体1 pcr产物4solution 1 5，4度连接过夜，然后转化到DH5 中，一天内都没有长菌，做了好几次，怀疑是不是连接中有问题，转化后的菌液为模版做了pcr鉴定，没有目的条带，请大家指点

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1楼 2016-03-01 09:05:15
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lrxpiao

新虫 (小有名气)
★
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有可能是载体或者（和）片段都没有处理好，重新制备载体或者（和）片段，应该就好了。另外，载体多加些，换用16℃过夜链接，以前我都是这么做的

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2楼2016-03-01 09:38:12
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amberhwk

新虫 (小有名气)
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2楼: Originally posted by lrxpiao at 2016-03-01 09:38:12
有可能是载体或者（和）片段都没有处理好，重新制备载体或者（和）片段，应该就好了。另外，载体多加些，换用16℃过夜链接，以前我都是这么做的

载体是买的，按照说明书比例加的是胶回收浓度太低吗

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3楼2016-03-01 13:39:52
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mlxmiao

木虫 (著名写手)
★
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一般是胶回收产物浓度太低。回收好后最好跑胶检测一下，别没有回收回来。

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4楼2016-03-01 14:32:34
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原海亮

木虫 (著名写手)
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首先楼主PCR扩增选用的酶可以末端加A么？如果可以，那么最好对PCR产物浓度跑胶看看，同时转化做感受态阴性对照，即不加连接产物的，看感受态是否有问题。如果不可以末端加A，楼主应该对PCR产物进行加A反应后，再同T载体连接。祝好

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天空才是极限，我有信心飞的更高！
5楼2016-03-01 14:33:28
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lrxpiao

新虫 (小有名气)
★
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3楼: Originally posted by amberhwk at 2016-03-01 13:39:52
载体是买的，按照说明书比例加的是胶回收浓度太低吗
...

TA克隆一般不会出现这种情况，片段浓度要高些。如果片段制备不是很麻烦的话，建议你重新做片段？另，片段大小多少？片段大的话，连上的可能会低些

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6楼2016-03-01 16:59:03
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amberhwk

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by lrxpiao at 2016-03-01 16:59:03
TA克隆一般不会出现这种情况，片段浓度要高些。如果片段制备不是很麻烦的话，建议你重新做片段？另，片段大小多少？片段大的话，连上的可能会低些
...

大概900bp

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7楼2016-03-01 17:58:49
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lrxpiao

新虫 (小有名气)
★
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这个片段不大，应该很好链接。排除这些可能性，恐怕就是片段的问题了。

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8楼2016-03-02 11:01:04
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