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pigg9

铁虫 (初入文坛)

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[求助] Ligation效率出奇的低，可以说根本没连上。求大家给点意见，谢谢

我现在在做一个长1700 bp, 73% GC含量的DNA序列的library。具体说的话就是将这段1700 bp的序列做error-prone-PCR,然后再将这段序列和vector用T4 ligase （NEB)相连组成一个长6700 bp的plasmid。至于连接的方式有两种：
1. 用Hind3和Spe1处理plasmid，然后gel pure vector. 之后再用SAP处理vector 2h.最后用T4 ligase （NEB)16℃连接16 h，此时的ligation scale为10 μL. 同时也做了vector-only的negative control. 当ligation结束后，取5μl的ligation溶液和100μL大肠杆菌做transformation （大肠杆菌的transformation效率有10E8)。最后取1/50的transformation liquid。结果是一个colony都没有。Control也没有。
2. 用Lgu1连接。这个就是先做PCR，将Lgu1连接在vector和insert的两端。然后在做一个T4 ligase和Lgu1共存的体系用于ligation （这个体系的ligation效率会很高这个是已经证明过了）。Negative control也是vector-only.之后按照1的transformation方法，得到的colony只比control高一点。

以上的vector和insert都是通过确定长度来保证序列的正确性。template的话用测序方法确定序列无误。所以说，insert和vector序列问题之类的估计可能性不会太大。并且insert和vector的摩尔比例也是在3：1. 但是最后是一个菌落也没有......
我的想法就是ligation效率太低，insert和vector根本连不上。在此请教一下各位，为什么我的ligation效率为何如此之低？有没有什么方法可以解决。小弟到目前为止，HOT START, 15%PET还有换T4 ligase以及换大肠杆菌这些全都都试过了。依旧毫无起色。而教授现在又在催数据，望各位帮个忙帮我看看我该怎么办😭。谢谢。🙇

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